Выделение ДНК и анализ ферментов рестрикции
- Изоляция ДНК <кнопка class="expand">Expand<ul class="lab-items">
- ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте вы проведете выделение ДНК в двух экспериментальных условиях: одно с использованием буфера, содержащего моющее средство SDS, и другое без моющего средства. Гипотезы: Альтернативная гипотеза для этого эксперимента может заключаться в том, что образец, приготовленный без SDS, сильного анионного детергента, разрушающего клеточные мембраны, даст меньше ДНК, чем образец, приготовленный с SDS. Нулевая гипотеза для этого эксперимента может заключаться в том, что оба образца дадут равное количество ДНК.
- Начать сбор образца ткани для выделения ДНК. Здесь вы будете использовать свои собственные клетки щеки. Используйте палочку от мороженого, чтобы соскабливать внутреннюю сторону щек в течение примерно 30 с. ВАЖНО: Не соскабливайте достаточно сильно, чтобы вызвать боль или кровотечение.
- Поместите воронку в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Затем возьмите 10 мл предоставленного вам 1% солевого раствора в чашке с маркировкой и прополощите его во рту, не глотая.
- Продолжайте полоскать полоскание в течение 90 секунд, а затем выплюйте физиологический раствор, содержащий клетки ваших щек, в воронку, чтобы собрать его в конической трубке.
- Далее пометьте две пустые микроцентрифужные пробирки своими инициалами.
- Обозначьте одну из пробирок как +SDS, а другую как -SDS, чтобы различать два лечения.
- Затем добавьте от 1,5 до 2 мл физиологического раствора, содержащего клетки щек, в каждую пробирку.
- Вращайте пробирки в микроцентрифуге в течение 30 секунд.
- Извлеките пробирки из микроцентрифуги и осторожно слейте надосадочную жидкость, не потревожив клетки, собранные на дне каждой пробирки.
- Наполните пробирки большим количеством физиологического раствора, содержащего клетки щек, и повторите центрифугирование.
- Повторите этот процесс, стараясь равномерно распределить клетки между пробирками +SDS и -SDS, пока все клетки щеки не будут собраны.
- Затем добавьте 1 мл буфера для лизиса, содержащего SDS, в пробирку, помеченную как +SDS, а затем повторно суспендируйте клеточную гранулу, пипетируя вверх и вниз.
- Затем добавьте 1 мл буфера для лизиса без SDS в пробирку, помеченную -SDS, и повторно суспендируйте клеточную гранулу, пипетируя вверх и вниз.
- После этого добавьте 10 μL протеиназы K в каждую пробирку, а затем осторожно поместите пробирки в водяную баню при температуре 56 ºC на 10 минут.
- Через 10 минут осторожно извлеките пробирки из водяной бани и добавьте 100 μL 2,5 M NaCl в каждую пробирку.
- Плотно закройте пробирки и переверните несколько раз, чтобы перемешать.
- Далее обозначьте одну коническую трубку объемом 15 мл как +SDS, а другую как -SDS.
- Налейте содержимое каждой микроцентрифужной пробирки в соответствующую коническую пробирку объемом 15 мл.
- Получите одну 10 мл аликвоты 100% этанола из морозильной камеры.
- Держите одну из конических пробирок под углом и медленно нанесите 1 мл 100% этанола в пробирку, чтобы образовался слой поверх жидкости, уже находящейся в пробирке.
- Повторите этот процесс для второй конической трубки.
- Теперь посмотрите на обе свои трубки. На границе раздела этанола и водного слоя под ним должен присутствовать волокнистый осадок. Этот волокнистый материал содержит выделенную ДНК. Сфотографируйте ДНК в пробирке и сделайте четкие описательные заметки и рисунки своих наблюдений в блокноте.
- С помощью стеклянного стержня для перемешивания возьмите ДНК из пробирки +SDS и исследуйте ее. Повторите это для трубки -SDS, снова записывая свои наблюдения. Обратите внимание на то, кажется ли в одной из трубок больше осадка, чем в другой, и почему это может быть так.
- Наконец, выбросьте все жидкие отходы в соответствующий контейнер для отходов и верните все инструменты на свои места в лаборатории.
- Виртуальный дайджест фермента ограничения
<кнопка class="expand">Expand
- Чтобы изучить, как работают ферменты рестрикции, сначала перейдите на веб-сайт New England Biolabs: https://www.neb.com/
- Ресурсы, доступные на этом сайте, позволяют исследователям проводить виртуальные эксперименты до того, как они будут выполнены в лаборатории. Нажмите на «Инструменты и ресурсы», чтобы найти инструмент NEBcutter и открыть программу.
- Справа от окна поиска найдите список с надписью "Вирус + фаг". Из этого списка выберите Lambda. Это название ДНК, которую вы будете переваривать. Выберите опцию «Линейная», где инструмент говорит «последовательность есть», и опцию «Ферменты NEB», где инструмент говорит: «Ферменты для использования». Затем нажмите кнопку Отправить.
- На следующей странице будет отображена полная карта ограничений ДНК лямбда. Эта карта рестрикций может быть использована для прогнозирования того, что произойдет при использовании определенных ферментов. Далее нажмите на «Пользовательский дайджест» под заголовком «Основные опции».
- Найдите фермент StuI и обратите внимание, что он оптимально работает в буфере 2.1 или буфере CS. Выберите фермент StuI и нажмите «Дайджест».
- В следующем окне нажмите на "Просмотреть gel" под заголовком "Основные параметры". Выберите опцию запуска виртуального 1% геля с помощью дайджеста pBR322-BstN1.
- После появления результатов сделайте скриншот и вставьте его в пустой документ.
- После этого вернитесь на главную страницу инструмента NEBcutter и выберите "Новый пользовательский дайджест".
- На этот раз ищите фермент BsrGI и обратите внимание, что он оптимально работает в буфере 2.1 или буфере 3.1. Выберите фермент и нажмите «Переварить».
- Под заголовком "Основные параметры" нажмите на "Просмотреть гель" и выберите параметры для запуска виртуального 1% геля с использованием дайджеста pBR322-BstN1.
- Сделай скриншот результатов и сохрани его в текстовом документе.
- Наконец, повторите эти шаги, используя StuI и BsrGI вместе в одном дайджесте.
- Опять же, сделай скриншот и сохрани полученный гель.
- Профилирование ДНК
<кнопка class="expand">Expand
- Перед началом фермента рестрикции сначала положите свои аликвоты лямбда-ДНК, NEB буфера 2.1, фермента StuI и фермента BsrGI в ведро со льдом и отнесите это на свою рабочую зону.
- Пометьте пробирку как StuI - это будет содержать дайджест StuI.
- Пометьте пробирку как BsrGI, чтобы содержать дайджест BsrGI.
- Затем пометьте пробирку S+B, чтобы содержать дайджест с обоими ферментами.
- Используйте соответствующие микропипетки для настройки реакций, перечисленных в таблице 1:Нажмите здесь, чтобы скачать таблицу 1
- Сначала нанесите 40 μL воды в каждую пробирку.
- Затем, используя каждый раз свежий наконечник для пипетки, нанесите 5 μL буфера 2.1 в каждую пробирку и пипеткой вверх и вниз для смешивания.
- Затем добавьте 4 μL лямбда-ДНК в каждую пробирку, а затем пипетку по 0,5 μL каждого фермента в соответствующие пробирки.
- Наконец, добавьте достаточное количество воды в каждую трубку, чтобы довести общий объем до 50 μл.
- Затем инкубируйте пробирки при температуре 37 ºC в течение 15 - 60 минут на водяной бане и верните буферы и ферменты в морозильную камеру.
- Чтобы приготовить агарозный гель для запуска дайджеста, в колбе объемом 250 мл смешайте 1 г агарозного порошка со 100 мл буфера TAE.
- Готовьте раствор в микроволновой печи примерно 90 с на полной мощности, стараясь не допустить выкипания раствора.
- Затем осторожно достаньте раствор из микроволновой печи с помощью перчатки или грелки и дайте ему остыть примерно на 15 минут.
- Пока агарозный раствор остывает, установите лоток для литья.
- Когда раствор агарозы остынет, добавьте в раствор 5 μL 10,000X SYBR Safe гелевого красителя.
- Добавьте гребень, который используется для изготовления лунок геля, в литейный лоток аппарата для гель-электрофореза.
- Налейте раствор агарозного геля в лоток для литья и дайте ему застыть.
- Как только гель затвердеет, потяните гребень прямо вверх, чтобы удалить его из геля, а затем снимите дамбы с лотка для литья, если это необходимо.
- Поместите гель в камеру электрофореза так, чтобы лунки располагались ближе всего к отрицательному или черному электроду, и заполните камеру 1x буфером TAE, чтобы полностью покрыть гель.
- Снимите свои образцы с водяной бани.
- Затем добавьте 8,3 μL загружающего красителя 6X в каждый образец.
- Выдайте 10 μL из дайджеста pBR322-BstN1, который содержит фрагменты ДНК известного размера, в первую лунку.
- Затем загрузите 25 μL образца StuI во вторую лунку.
- Поместите 25 μL образца BsRGI в третью лунку.
- Загрузите 25 μL образца S+B в четвертую лунку.
- Чтобы запустить гель, вставьте провода в камеру электрофореза, а затем в блок питания. Красный положительный свинец должен находиться на самом дальнем конце от скважин, а черный отрицательный свинец должен быть ближе всего к скважинам. Это связано с тем, что образцы будут переходить от отрицательных к положительным.
- Включите блок питания и установите гелевую коробку на работу при напряжении 170 вольт примерно на 60 минут.
- После завершения прогона выключите питание гелевого бокса и отсоедините электроды от бака.
- Затем извлеките гель из камеры электрофореза и наблюдайте за ним с помощью ультрафиолетового трансиллюминатора. ВНИМАНИЕ: Защищайте глаза от ультрафиолета, надев защитные очки или используя прилагаемый щиток.
- Наконец, используйте камеру мобильного телефона, чтобы сфотографировать гель прямо сверху и параллельно поверхности геля.
- Результаты
<кнопка class="expand">Expand
- Сравните гель, который вы запустили в лаборатории, с вашим виртуальным ферментативным дайджестом с StuI.
- Виртуальный дайджест с StuI привел к семи полосам. Посчитайте полосы на полосе StuI вашего геля и отметьте, совпадают ли они с виртуальным дайджестом или показывают аналогичную картину. ПРИМЕЧАНИЕ: Маленькие полосы на агарозных гелях для электрофореза часто незаметны.
- Теперь посмотрите на результаты вашего дайджеста BsrGI. В результате виртуального дайджеста с BsrGI получилось шесть полос. Посчитайте полосы в полосе BsrGI. Опять же, обратите внимание на то, показали ли виртуальный дайджест и лабораторный дайджест одну и ту же или похожую закономерность.
- Наконец, взгляните на виртуальный дайджест с StuI и BsrGI. В результате виртуального дайджеста с обоими ферментами было получено 12 полос. Посчитайте полосы в соответствующей полосе вашего геля и подумайте, похожа ли структура полос ДНК на виртуальный дайджест.
Q1: Why is SDS used in the DNA isolation lysis buffer?
SDS is a strong anionic detergent that breaks apart cell membranes, allowing cells to lyse and release their DNA. The experiment compares DNA yield from samples prepared with and without SDS to demonstrate how detergent enhances cell membrane disruption and DNA recovery from cheek cells.
Q2: What is the purpose of proteinase K in DNA isolation?
Proteinase K is an enzyme that digests proteins associated with DNA, including histones and other cellular proteins. Adding proteinase K and incubating samples at 56°C for 10 minutes helps purify the DNA by removing protein contaminants that would otherwise interfere with downstream analysis.
Q3: How does ethanol precipitation isolate DNA from solution?
Ethanol is a nonpolar solvent that causes DNA to become insoluble and precipitate out of the aqueous solution. When 100% ethanol is carefully layered over the cell lysate, stringy DNA precipitate forms at the interface between the ethanol and aqueous layers, allowing visual isolation and collection of the DNA.
Q4: What does a restriction enzyme digest reveal about DNA structure?
Restriction enzymes cut DNA at specific recognition sequences, producing fragments of predictable sizes. By comparing virtual digests to actual gel results, students can verify enzyme specificity and understand how restriction enzyme analysis identifies DNA sequences and creates unique banding patterns for DNA profiling.
Q5: Why are different buffers required for different restriction enzymes?
Restriction enzymes have optimal pH and salt conditions for catalytic activity. StuI works optimally in buffer 2.1 or CS buffer, while BsrGI performs best in buffer 2.1 or buffer 3.1. Using the correct buffer ensures maximum enzyme efficiency and accurate DNA digestion results during restriction enzyme analysis.
Q6: How does gel electrophoresis separate DNA fragments by size?
DNA fragments migrate through an agarose gel matrix when an electric current is applied, with smaller fragments moving faster toward the positive electrode than larger ones. After staining with SYBR Safe dye and UV visualization, distinct bands appear representing DNA fragments of different sizes, allowing comparison between single and double enzyme digests.
Q7: What does combining two restriction enzymes in a single digest demonstrate?
Using both StuI and BsrGI together produces more DNA fragments than either enzyme alone, demonstrating additive cutting at different recognition sites. The virtual digest with both enzymes yields 12 bands compared to 7 for StuI and 6 for BsrGI, illustrating how multiple restriction sites create unique DNA profiles for identification purposes.