Активность ферментов
- Эксперимент с ферментом пероксидазой
- Для начала необходимо определить базовый уровень для реакции фермента пероксидазы. Сделайте субстрат, добавив в чистую пробирку 7 мл дистиллированной воды, а затем добавьте 0,2 мл гваякола. Примечание: Гваякол — это индикатор, изменяющий цвет, который становится более желто-оранжевым по мере развития ферментной реакции.
- Затем добавьте 0,3 мл 0,1% H2O2.
- С помощью маркера пометьте подложку для пробирки, а затем накройте пробирку куском герметизирующей пленки.
- Удерживая крышку на месте, переверните пробирку четыре раза, чтобы перемешать содержимое пробирки.
- Во вторую пробирку добавьте 6,0 мл дистиллированной воды и 1,5 мл пероксидазы репы и пометьте эту пробирку "Фермент".
- Накройте эту пробирку новым куском герметизирующей пленки и смешайте эти растворы четырьмя инверсиями, как описано ранее (шаг 4).
- Когда обе пробирки будут смешаны, поставьте таймер на стол, рядом со штативом для пробирок, затем вылейте содержимое пробирки с подложкой в пробирку с ферментом, стараясь не пролить жидкость.
- Затем вылейте весь объем из пробирки с ферментом обратно в пробирку подложки, чтобы тщательно перемешать растворы, и накройте пробирку подложки еще одним куском герметизирующей пленки.
- Положите пробирку в штатив и запустите таймер.
- Наблюдайте за цветом в субстратной пробирке через 0, 1, 2, 3, 4 и 5 минут, после смешивания.
- Чтобы количественно оценить относительное изменение цвета и скорость реакции, сопоставьте наблюдаемый цвет с ближайшим цветом в стандарте. ПРИМЕЧАНИЕ: Фотографирование наблюдаемой интенсивности цвета в каждой точке отбора проб может облегчить запись результатов.
- Запишите цвета, которые вы видите в таблице. Нажмите здесь, чтобы скачать таблицу 1
- Исследование влияния pH на активность пероксидазы
- ГИПОТЕЗЫ: В этом упражнении экспериментальная гипотеза заключается в том, что скорость реакции достигнет максимума или оптимума при среднем нейтральном pH и что эти скорости будут выше или примерно равны исходной скорости. Нулевая гипотеза заключается в том, что не будет никаких различий в скорости реакции между исходным уровнем и обработкой pH.
- Сначала пометьте шесть чистых пробирок для каждого из шести уровней pH буфера 3 - 8 и слово "Enzyme".
- Затем добавьте 6 мл соответствующих буферных растворов pH, предоставленных вашим инструктором, в каждую из пробирок.
- Затем добавьте 1,5 мл пероксидазы репы в каждую пробирку, стараясь не загрязнить пипетку буферным раствором.
- Накройте пробирки с ферментами герметизирующей пленкой и аккуратно переверните каждую пробирку, чтобы перемешать содержимое пробирки.
- Как описано в эксперименте с базовыми реакциями, сделайте субстраты для этих реакций, добавив 7 мл дистиллированной воды, 0,2 мл гваякола и 0,3 мл 0,1% H2O2 в шесть новых чистых пробирок.
- Далее пометьте шесть дополнительных чистых пробирок уровнями pH 3 - 8 и словом "Раствор" и подготовьте таймер.
- Быстро работая, налейте пробирку с субстратом и пробирку с pH в соответствующую пробирку с раствором. Повторите этот шаг для каждого из различных уровней pH.
- Затем накройте пробирки герметизирующей пленкой и смешайте каждую пробирку с четырьмя инверсиями. Поместите каждую пробирку в штатив для пробирок, по мере их перемешивания.
- Наблюдайте за цветом в каждой пробирке в момент времени 0 и немедленно запускайте таймер. Продолжайте наблюдать за цветом в каждой трубке с интервалом в каждую минуту, до 5 минут.
- На каждом интервале используйте цветовой код в стандарте, чтобы записать наблюдаемые цвета в вашей таблице.
- Исследование влияния температуры на активность пероксидазы
- ГИПОТЕЗЫ: В этом упражнении экспериментальная гипотеза заключается в том, что скорость реакции достигнет оптимальной температуры выше комнатной температуры, или 23 °C, но ниже скорости денатурации фермента, и что этот максимум будет выше исходной скорости. Нулевая гипотеза состоит в том, что не будет никаких различий в скорости реакции между исходным уровнем и температурной обработкой.
- Наполните стакан объемом 800 мл примерно на полпути к верху льдом и налейте в него холодную воду, чтобы создать ледяную ванну. Обозначьте этот стакан как "Ice".
- Затем пометьте четыре новых стакана объемом 600 мл с той же температурой, что и ваши субстратные трубки, и добавьте в каждый по 150 мл водопроводной воды.
- Используя горячую плиту и термометр, нагрейте стаканы до 25, 35, 45 и 60 °C, как указано на этикетках.
- Приготовьте еще пять пар субстрата и пробирок с ферментами, как описано для базовой реакции, используя дистиллированную воду в пробирке с ферментом, вместо буфера pH.
- Пометьте трубки с подложкой как "Лед", "25 °C", "35 °C", "45 °C" и "60 °C".
- Когда все водяные бани достигнут соответствующих температур, смешайте субстрат и растворы ферментов вместе, сначала налив содержимое каждой пробирки субстрата в пробирку с ферментом, а затем вылив содержимое пробирки с ферментом обратно в пробирку с субстратом.
- Накройте трубки подложки герметизирующей пленкой и наблюдайте за цветами в момент времени 0.
- Затем поставьте трубки в соответствующие ванны для стаканов, основываясь на температурной этикетке, которую получила каждая трубка, и запустите таймер.
- Для каждого интервала в 1 минуту вынимайте трубки из воды и записывайте их цвет, используя stabdard в качестве эталона.
- Затем поместите их в ванны, пока не будет записан каждый момент времени, до 5 минут.
- Результаты
- Чтобы определить базовый уровень реакции, построите график изменения интенсивности цвета во времени. ПРИМЕЧАНИЕ: Количество единиц, на которые цвет увеличился за 5-минутный период времени, будет служить базовой скоростью реакции для относительного сравнения.
- Теперь рассмотрим разницу в интенсивности цвета по сравнению с уровнями pH, используемыми в первом эксперименте.
- Добавьте базовый уровень для сравнения, а затем определите, была ли оптимальная скорость реакции выше, ниже или равна исходному уровню.
- Используя этот график, определите оптимальный pH для реакции. Примечание: Реакция может возникать не при каждом pH. Оптимальный pH для фермента пероксидазы обычно находится в диапазоне 6 - 7. Подвергая фермент воздействию субстрата с различными уровнями pH, вы заметите снижение скорости реакции, поскольку pH фермента становится более основным, что делает фермент более нестабильным.
- Наконец, изобразим график разницы в интенсивности цвета с течением времени для разных температур, использованных во втором эксперименте, используя тот же базовый уровень для сравнения.
- Используя этот график, определите оптимальную температуру для реакции и сравните ее с базовым уровнем. ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция может протекать не при каждой температуре. В этом эксперименте реакция кажется наиболее эффективной при температуре около 45 °C, и при превышении этого значения фермент пероксидаза начинает денатурировать. По этой причине он не должен вызывать изменения цвета в стакане при температуре 60 °C. Скорость реакции также замедлится или остановится в ледяной бане, так как у фермента недостаточно энергии для катализации реакции.
View the full transcript and gain access to JoVE Lab Manual videos
Q1: What is guaiacol and why is it used in the peroxidase enzyme experiment?
Guaiacol is a color-changing indicator that becomes progressively more yellow-orange as the peroxidase enzyme reaction progresses. It allows researchers to visually track enzyme activity by observing the color intensity change over time, making it possible to quantify the relative reaction rate by comparing observed colors to a standard reference.
Q2: How do you prepare the substrate and enzyme solutions for the baseline peroxidase reaction?
The substrate is prepared by combining 7 mL distilled water, 0.2 mL guaiacol, and 0.3 mL of 0.1% hydrogen peroxide in a test tube. The enzyme solution contains 6.0 mL distilled water and 1.5 mL turnip peroxidase. Both are mixed separately by four inversions, then combined and mixed again before timing begins.
Q3: What is the optimal pH range for peroxidase enzyme activity?
The optimal pH for peroxidase enzyme activity is typically in the range of 6 to 7, representing a mid-range neutral pH. As pH becomes more basic, enzyme stability decreases and reaction rates drop significantly. Testing pH levels 3 through 8 reveals this optimal range through color intensity measurements.
Q4: Why does peroxidase enzyme activity decrease at high temperatures?
At high temperatures, the peroxidase enzyme begins to denature, losing its three-dimensional structure and catalytic ability. Above 45 degrees Celsius, the enzyme becomes increasingly unstable and produces little to no color change. At 60 degrees Celsius, the enzyme is sufficiently denatured that the reaction does not occur.
Q5: What is the optimal temperature for peroxidase enzyme activity in this experiment?
The peroxidase enzyme shows maximum efficiency around 45 degrees Celsius in this experiment. This temperature balances sufficient molecular energy for catalysis with enzyme stability. Below this temperature, reaction rates are slower, and above it, enzyme denaturation significantly reduces activity and color production.
Q6: How does temperature affect enzyme reaction rates at low temperatures?
At low temperatures, such as in an ice bath, the reaction rate slows or stops because there is insufficient molecular energy for the enzyme to catalyze the reaction effectively. Reduced thermal energy limits enzyme-substrate collisions and the rate of product formation, resulting in minimal or no observable color change.
Q7: How do you quantify enzyme activity changes in this peroxidase experiment?
Enzyme activity is quantified by graphing color intensity changes against time or experimental conditions. The baseline reaction establishes a reference rate measured in color units over five minutes. Comparing pH and temperature treatments to this baseline reveals how environmental factors affect reaction rates and enzyme efficiency.