Выделение ДНК и анализ ферментов рестрикции

Экстракция ДНК – это удаление и очистка ДНК из клеток. Во-первых, клетки лизируются - вскрываются - обычно с помощью комбинации физического разрушения и обработки химическими веществами, такими как моющее средство, которое растворяет клетку и ядерные мембраны. SDS или додецилсульфат натрия является широко используемым детергентом, который работает за счет солюбилизации белков и липидов, входящих в состав этих мембран. Затем содержимое может свободно плавать в окружающем растворе.

Затем ДНК должна быть отделена от других присутствующих молекул. Добавленная в реакцию протеиназа К разрушает пептидные связи и переваривает загрязняющие белки. Затем в образец добавляют соль, которая стабилизирует отрицательно заряженные фосфатные группы в позвоночнике ДНК и после добавления ледяного спирта высаживает ДНК из раствора. Белый осадок собирается путем вращения его в центрифуге, где он оседает на дно пробирки. После промывки и ресуспендирования в буферном растворе извлеченная ДНК может быть использована в исследованиях или биотехнологиях.

Некоторые биотехнологические приложения, такие как ДНК-дактилоскопия, которые могут идентифицировать новые паттерны в ДНК, специфичные для человека или людей, включают использование ферментов рестрикции. Ферменты рестрикции — это молекулы, которые взаимодействуют с ДНК и распознают определенные последовательности. Как только их конкретный участок идентифицирован, они разрезают ДНК. В результате прядь будет разрезана на одну или несколько линейных частей. Если выделенная ДНК была плазмидой, кольцевым участком ДНК, чаще всего встречающимся у бактерий, любые разрезы приведут к тому, что ДНК образует линейный фрагмент или фрагменты. Различные ферменты рестрикции распознают разные последовательности ДНК, поэтому использование их комбинации может привести к образованию отдельных фрагментов.

При ДНК-дактилоскопии мы можем затем исследовать эти фрагменты с помощью метода, называемого ДНК или гель-электрофорезом. Для приготовления гелей порошкообразную агарозу смешивают с буфером и нагревают до растворения. Затем в теплую смесь добавляют нуклеотидное красило, а затем этот раствор заливают в литейную форму. Для формирования лунок вставляется гребень. После застывания гель перекладывается в гелевую коробку, заполненную буфером, и гребень удаляется. Эталонная смесь окрашенных фрагментов ДНК известной длины, лестница ДНК, добавляется в одну лунку, а окрашенные образцы ДНК, представляющие интерес, загружаются в остальные лунки. Коробка подключается к источнику питания, и включение питания индуцирует миграцию отрицательно заряженных фосфатных групп в нуклеотидах ДНК через гель к аноду, положительному концу. Более мелкие фрагменты движутся быстрее, чем более крупные фрагменты, которые мигрируют с трудом.

Когда прогон завершен, гель подвергается воздействию ультрафиолетового света для визуализации нуклеотидного окрашивания в образцах ДНК. Их присутствие может быть подтверждено на основе их относительного расположения относительно лестничных лент. Поскольку ДНК с разными последовательностями будет иметь участки разреза в разных местах, это может привести к появлению новых полос или отпечатков пальцев, которые могут быть использованы для различения отдельных лиц или вариантов профилей ДНК.

В этой лаборатории вы проведете экстракцию ДНК с использованием буфера с SDS и без него, чтобы оценить важность детергентов в выделении ДНК, а затем переварите плазмидную ДНК с различными ферментами рестрикции для изучения полученных профилей ДНК.