Выделение ДНК и анализ ферментов рестрикции
Открытие ДНК как наследственной молекулы во всех организмах привело к огромным научным и медицинским прорывам и значительно улучшило наше понимание се…
Экстракция ДНК – это удаление и очистка ДНК из клеток. Во-первых, клетки лизируются - вскрываются - обычно с помощью комбинации физического разрушения и обработки химическими веществами, такими как моющее средство, которое растворяет клетку и ядерные мембраны. SDS или додецилсульфат натрия является широко используемым детергентом, который работает за счет солюбилизации белков и липидов, входящих в состав этих мембран. Затем содержимое может свободно плавать в окружающем растворе.
Затем ДНК должна быть отделена от других присутствующих молекул. Добавленная в реакцию протеиназа К разрушает пептидные связи и переваривает загрязняющие белки. Затем в образец добавляют соль, которая стабилизирует отрицательно заряженные фосфатные группы в позвоночнике ДНК и после добавления ледяного спирта высаживает ДНК из раствора. Белый осадок собирается путем вращения его в центрифуге, где он оседает на дно пробирки. После промывки и ресуспендирования в буферном растворе извлеченная ДНК может быть использована в исследованиях или биотехнологиях.
Некоторые биотехнологические приложения, такие как ДНК-дактилоскопия, которые могут идентифицировать новые паттерны в ДНК, специфичные для человека или людей, включают использование ферментов рестрикции. Ферменты рестрикции — это молекулы, которые взаимодействуют с ДНК и распознают определенные последовательности. Как только их конкретный участок идентифицирован, они разрезают ДНК. В результате прядь будет разрезана на одну или несколько линейных частей. Если выделенная ДНК была плазмидой, кольцевым участком ДНК, чаще всего встречающимся у бактерий, любые разрезы приведут к тому, что ДНК образует линейный фрагмент или фрагменты. Различные ферменты рестрикции распознают разные последовательности ДНК, поэтому использование их комбинации может привести к образованию отдельных фрагментов.
При ДНК-дактилоскопии мы можем затем исследовать эти фрагменты с помощью метода, называемого ДНК или гель-электрофорезом. Для приготовления гелей порошкообразную агарозу смешивают с буфером и нагревают до растворения. Затем в теплую смесь добавляют нуклеотидное красило, а затем этот раствор заливают в литейную форму. Для формирования лунок вставляется гребень. После застывания гель перекладывается в гелевую коробку, заполненную буфером, и гребень удаляется. Эталонная смесь окрашенных фрагментов ДНК известной длины, лестница ДНК, добавляется в одну лунку, а окрашенные образцы ДНК, представляющие интерес, загружаются в остальные лунки. Коробка подключается к источнику питания, и включение питания индуцирует миграцию отрицательно заряженных фосфатных групп в нуклеотидах ДНК через гель к аноду, положительному концу. Более мелкие фрагменты движутся быстрее, чем более крупные фрагменты, которые мигрируют с трудом.
Когда прогон завершен, гель подвергается воздействию ультрафиолетового света для визуализации нуклеотидного окрашивания в образцах ДНК. Их присутствие может быть подтверждено на основе их относительного расположения относительно лестничных лент. Поскольку ДНК с разными последовательностями будет иметь участки разреза в разных местах, это может привести к появлению новых полос или отпечатков пальцев, которые могут быть использованы для различения отдельных лиц или вариантов профилей ДНК.
В этой лаборатории вы проведете экстракцию ДНК с использованием буфера с SDS и без него, чтобы оценить важность детергентов в выделении ДНК, а затем переварите плазмидную ДНК с различными ферментами рестрикции для изучения полученных профилей ДНК.
Экстракция ДНК – это удаление и очистка ДНК из клеток. Во-первых, клетки лизируются - вскрываются - обычно с помощью комбинации физического разрушения и обработки химическими веществами, такими как моющее средство, которое растворяет клетку и ядерные мембраны. SDS или додецилсульфат натрия является широко используемым детергентом, который работает за счет солюбилизации белков и липидов, входящих в состав этих мембран. Затем содержимое может свободно плавать в окружающем растворе.
Затем ДНК должна быть отделена от других присутствующих молекул. Добавленная в реакцию протеиназа К разрушает пептидные связи и переваривает загрязняющие белки. Затем в образец добавляют соль, которая стабилизирует отрицательно заряженные фосфатные группы в позвоночнике ДНК и после добавления ледяного спирта высаживает ДНК из раствора. Белый осадок собирается путем вращения его в центрифуге, где он оседает на дно пробирки. После промывки и ресуспендирования в буферном растворе извлеченная ДНК может быть использована в исследованиях или биотехнологиях.
Некоторые биотехнологические приложения, такие как ДНК-дактилоскопия, которые могут идентифицировать новые паттерны в ДНК, специфичные для человека или людей, включают использование ферментов рестрикции. Ферменты рестрикции — это молекулы, которые взаимодействуют с ДНК и распознают определенные последовательности. Как только их конкретный участок идентифицирован, они разрезают ДНК. В результате прядь будет разрезана на одну или несколько линейных частей. Если выделенная ДНК была плазмидой, кольцевым участком ДНК, чаще всего встречающимся у бактерий, любые разрезы приведут к тому, что ДНК образует линейный фрагмент или фрагменты. Различные ферменты рестрикции распознают разные последовательности ДНК, поэтому использование их комбинации может привести к образованию отдельных фрагментов.
При ДНК-дактилоскопии мы можем затем исследовать эти фрагменты с помощью метода, называемого ДНК или гель-электрофорезом. Для приготовления гелей порошкообразную агарозу смешивают с буфером и нагревают до растворения. Затем в теплую смесь добавляют нуклеотидное красило, а затем этот раствор заливают в литейную форму. Для формирования лунок вставляется гребень. После застывания гель перекладывается в гелевую коробку, заполненную буфером, и гребень удаляется. Эталонная смесь окрашенных фрагментов ДНК известной длины, лестница ДНК, добавляется в одну лунку, а окрашенные образцы ДНК, представляющие интерес, загружаются в остальные лунки. Коробка подключается к источнику питания, и включение питания индуцирует миграцию отрицательно заряженных фосфатных групп в нуклеотидах ДНК через гель к аноду, положительному концу. Более мелкие фрагменты движутся быстрее, чем более крупные фрагменты, которые мигрируют с трудом.
Когда прогон завершен, гель подвергается воздействию ультрафиолетового света для визуализации нуклеотидного окрашивания в образцах ДНК. Их присутствие может быть подтверждено на основе их относительного расположения относительно лестничных лент. Поскольку ДНК с разными последовательностями будет иметь участки разреза в разных местах, это может привести к появлению новых полос или отпечатков пальцев, которые могут быть использованы для различения отдельных лиц или вариантов профилей ДНК.
В этой лаборатории вы проведете экстракцию ДНК с использованием буфера с SDS и без него, чтобы оценить важность детергентов в выделении ДНК, а затем переварите плазмидную ДНК с различными ферментами рестрикции для изучения полученных профилей ДНК.
Q1: Why is SDS used during DNA extraction?
SDS, or sodium dodecyl sulfate, is a detergent that dissolves the lipids and proteins making up cell and nuclear membranes. By solubilizing these membrane components, SDS allows the cell contents, including DNA, to float freely into the surrounding solution, making DNA accessible for further purification steps.
Q2: What role does Proteinase K play in DNA isolation?
Proteinase K is an enzyme that breaks down peptide bonds in proteins, digesting contaminating proteins like histones that bind to DNA. This separation is essential because DNA is tightly condensed around histone proteins inside the nucleus, and removing these proteins allows pure DNA to be recovered.
Q3: How does salt help precipitate DNA from solution?
Salt, typically sodium chloride, stabilizes DNA by allowing Na+ ions to bind to and integrate into the negatively charged phosphate groups in the DNA backbone. This causes DNA strands to clump together, making the precipitate visible and collectible by centrifugation.
Q4: What determines where restriction enzymes cut DNA?
Restriction enzymes recognize and cut DNA at specific nucleotide sequences, typically six to twelve nucleotides long and usually palindromic, meaning they read the same in both the 3'-5' and 5'-3' directions. Different restriction enzymes recognize different sequences, allowing researchers to produce distinct DNA fragments for analysis.
Q5: Why do smaller DNA fragments move faster through gel electrophoresis?
During gel electrophoresis, negatively charged DNA migrates toward the anode through the gel matrix. Smaller DNA fragments navigate the gel's pores more easily than larger fragments, which experience greater resistance and migrate with difficulty, causing size-based separation of DNA pieces.
Q6: How can restriction enzyme digestion create unique DNA fingerprints?
Because different DNA sequences have cut sites at different locations, digesting DNA with restriction enzymes produces novel band patterns specific to each individual's genetic profile. These unique patterns, visualized through gel electrophoresis, can distinguish individuals or variant DNA profiles for forensic and genetic analysis.
Q7: What happens to plasmid DNA when restriction enzymes cut it?
Plasmids are circular DNA molecules commonly found in bacteria. When restriction enzymes cut a plasmid at their recognition sites, the circular DNA becomes linear, forming one or more linear fragments. These fragments can then be isolated and ligated into vectors for bacterial transformation using plasmids procedure applications.