15.13: Комплементарная ДНК

Обзор

Активны или выражены только гены, транскрибированные в РНК-мессенджер (мРНК). Таким образом, ученые могут извлекать мРНК из клеток для изучения экспрессии генов в различных клетках и тканях. Ученый преобразует мРНК в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскрипции. Поскольку мРНК не содержит интронов (некодирующих регионов) и других нормативных последовательностей, кДНК, в отличие от геномной ДНК, также позволяет исследователям напрямую определять аминокислотную последовательность пептида, кодируемого геном.

Синтез cDNA

cDNA может быть сгенерирован несколькими методами, но общий способ заключается в том, чтобы сначала извлечь общую РНК из клеток, а затем изолировать мРНК от более преобладающих типов- передачи РНК (тРНК) и рибосомной (рРНК). Зрелая эукариотическая мРНК имеет поли(А) хвост – вереницу нуклеотидов аденина – добавленную к ее 3′ концу, в то время как другие типы РНК этого не делают. Таким образом, строка нуклеотидов тимина (олиго-дэ) может быть прикреплена к субстрату, такому как колонка или магнитные бусы, к специально базовой паре с поли(А) хвостами мРНК. В то время как мРНК с поли(А) хвост захвачен, другие типы РНК смываются.

Далее, обратная транскриптаза – фермент полимеразы ДНК из ретровирусов – используется для генерации кДНК из мРНК. Так как, как и большинство полимераз ДНК, обратная транскриптаза может добавить нуклеотиды только к 3 ‘конец цепи, поли (T) грунтовка добавляется, чтобы связать с поли (A) хвост, чтобы обеспечить отправную точку для синтеза кДНК. Цепь cDNA заканчивается в петле шпильки. РНК затем деградирует, как правило, при щелочной обработке или обрабоке RNase ферментов, оставляя одноцепочечную кДНК нетронутой.

Вторая цепь ДНК дополняет cDNA затем синтезируется полимеразы ДНК-часто с помощью шпильки петли первой цепи cDNA или заимствованным участком мРНК в качестве праймера.

В результате двухместный кДНК может быть вставлен в бактериальные или вирусные векторы и клонирован с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Библиотека cDNA, представляющая все мРНК в клетках или тканях, представляющих интерес, также может быть построена для дополнительных исследований.