15.14: ПЦР

Обзор

Полимераза цепной реакции, или ПЦР, является широко используемым методом для копирования сегментов ДНК. Благодаря экспоненциальному усилению, ПЦР может производить миллионы или миллиарды копий ДНК в течение нескольких часов. В реакции ПЦР, термостойкий фермент полимеразы ДНК усиливает исходную ДНК через ряд изменений температуры внутри автоматизированной машины под названием термоциклер.

ПЦР является универсальным методом, который революционизировал молекулярную биологию

Кари Маллис разработал ПЦР в 1983 году, за что был удостоен Нобелевской премии по химии 1993 года. Будучи относительно быстрым, недорогим и точным способом копирования последовательности ДНК, ПЦР стал бесценным инструментом для многочисленных применений, включая молекулярное клонирование, генный мутагенез, обнаружение патогенов, анализ экспрессии генов, квантификацию и секвенирование ДНК, а также диагностику генетических заболеваний.

Цикл реакции ПЦР

ПЦР имитирует естественный процесс репликации ДНК, который происходит в клетках. Смесь реакции включает в себя шаблон последовательности ДНК, которые будут скопированы, пара коротких молекул ДНК называется грунтовки, свободные строительные блоки ДНК называется дезоксинуклеотид трифосфатов (dNTPs), и специализированный фермент полимеразы ДНК.

ПЦР включает в себя ряд шагов при высоких температурах, требующих фермента полимеразы ДНК, который функционирует при таких температурах. Наиболее часто используемой полимеразой ДНК является полимераза Taq, названная в честь Thermus aquaticus, бактерии, из которой полимераза была первоначально изолирована. Полимераза ДНК не в состоянии синтезировать молекулу ДНК с нуля, или de novo. Вместо этого полимераза ДНК добавляет к коротким молекулам ДНК, называемым грунтовки, которые связываются с шаблоном ДНК через дополнительное базовое спаривание. Праймеры обеспечивают бесплатную 3' гидроксиловую группу, к которой полимераза ДНК может прикреплять новые dNTPs. В ПЦР есть четыре типа dNTP, по одному для каждого нуклеотида в молекуле ДНК: DATP, dCTP, dGTP и dTTP.

Каждый цикл ПЦР состоит из трех этапов: денатурации, аннеаляции и синтеза ДНК.

1. Денатурация. Цикл ПЦР инициируется нагреванием реакционной смеси до высокой температуры, вызывая разделение двойной спирали ДНК на две нити. Этот процесс «плавления» обычно происходит при температуре 90 градусов по Цельсию.
2. Отжига. Реакционная смесь быстро охлаждается (обычно до 50 градусов по Цельсию, что позволяет двум грунтовким связываться с их дополнительными последовательностями на нитей ДНК шаблона.
3. Синтез ДНК (расширение грунта). Реакционная смесь нагревается снова, на этот раз до температуры (обычно 60 градусов по Цельсию), что позволяет полимеразе ДНК расширять грунтовки, добавляя dNTPs, которые в паре с основаниями в нити шаблона.

Типичный ПЦР включает в себя 20-40 повторяющихся циклов этих трех шагов, происходящих в термоциклере. Так как количество молекул ДНК удваивается в каждом цикле, ДНК усиливается в геометрической прогрессии.

Ограничения ПЦР

Если ученый хочет усилить определенный участок генома, ученый должен знать, по крайней мере, часть целевой последовательности ДНК для разработки соответствующих праймеров. Другой потенциальной проблемой является неспецифическое анналирование грунтовок для частично аналогичных последовательностей ДНК, что приводит к усилению нецелевой ДНК. Эту проблему можно контролировать путем оптимизации условий реакции. Будучи высокочувствительным методом обнаружения, ПЦР также уязвим для загрязнения, и даже след от загрязняющих ДНК может привести к вводящим в заблуждение результатам. Полимеразы ДНК, используемые в ПЦР, могут быть подвержены ошибкам. Если мутация происходит в течение первых нескольких циклов, большая часть усиленной ДНК будет нести мутации.

Цель ПЦР, полимерной цепной реакции, амплификация генетической последовательности. В этом примере целевой ген будет амплифицирован из очищенной ДНК. Для обеспечения амплификации требуется полимераза, чтобы синтезировать новую ДНК.

Праймер, короткий участок одноцепочечной ДНК, который разделяет гомологию с интересующим геном, также необходим. Наконец, единичные нуклеотиды, дезоксинуклеотидные трифосфаты, или дНТП, используются чтобы создать новую цепочку. Первый шаг в ПЦР подогрев смеси, что денатурирует ДНК.

Затем реакция охлаждается, а праймеры будут рекомбинироваться в их гомологичный регион. После связывания, реакция нагревается до оптимальной температуры для полимеразы. После этого полимераза распознает комплекс ДНК-праймера и начинает синтезировать новую цепочку, используя дНТП в растворе.

Затем реакция нагревается и продолжается, как описано выше в дополнительных циклах. После третьего цикла всего имеется восемь копий гена. После четвёртого цикла шестнадцать копий.

После пятого цикла тридцать два экземпляра. Количество копий будет продолжает расти экспоненциально. После тридцати циклов, получится более одного миллиарда копий.