Тонкослойная хроматография

Источник: Лара Аль Харири и Ахмед Басабрэйн из Массачусетского университета в Амхерсте, штат Массачусетс, США

1. Влияние подвижной фазовой композиции на разделение соединений<кнопка class="expand">Expand

   В этом разделе лабораторной работы вы будете использовать TLC, чтобы сравнить, насколько хорошо чистый гексан и смесь 60% гексана и 40% этилацетата могут разделять фенол, бензойную кислоту и бутилфениловый эфир, измеряя расстояние, пройденное соединением в каждом растворителе.

   • Перед началом лаборатории наденьте лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки. Примечание: Гексан и этилацетат летучи, токсичны и легковоспламеняются, поэтому всегда работайте с ними в вытяжном шкафу. Смените перчатки, если на них попал растворитель, так как гексан и этилацетат проникнут в нитриловые перчатки в течение нескольких минут.
   • Теперь достаем бумажное полотенце и стелем его на столе. Аккуратно поднимите пластину TLC с помощью пинцета на самом конце пластины. заметка: Всегда держите пластины TLC за края или на самом верху пинцетом, чтобы не повредить или не загрязнить силикагель.
   • Ищите сколы или царапины в силикагеле и при необходимости приобретите новую пластину. Ничего страшного, если только на одном конце будет небольшой скол, так как он может быть верхним.
   • Положите тарелку на бумажное полотенце в вытяжном шкафу и положите рядом с ней метрическую линейку. С помощью графитового карандаша аккуратно сделайте небольшую отметку на силикагеле ~1 см от верхней части тарелки. Напишите «100» на табличке над отметкой.
   • Затем аккуратно отметьте пластину на 1 см выше дна с обеих сторон. Аккуратно проведите прямую линию между нижними отметками, чтобы получилась начальная линия.
   • Затем добавьте 3 равномерно расположенные маленькие метки на стартовую линию, внешние отметки должны находиться на расстоянии не менее 0,5 см от сторон пластины. заметка: Важно, чтобы силикагель здесь не был поврежден, поэтому если вы поцарапали его карандашом, подготовьте новую пластину.
   • Теперь обведите контур пластины TLC в своем лабораторном блокноте и точно скопируйте отметки на пластине. Обозначьте три маркировки как «фенол», «бензойная кислота» и «бутилфениловый эфир». Вы также можете захотеть нанести метки на саму табличку.
   • Подготовьте вторую пластину TLC с маркировкой '60/40' таким же образом. Теперь поднесите маркированные пластины к общему столу и найдите растворы фенола, бензойной кислоты и бутилфенилового эфира в этаноле с концентрацией 1 мг/мл.
   • Опустите чистый капилляр в один из трех растворов. Коротко и слегка промокните капилляр прямо напротив пересечения между начальной линией и отметкой для этого состава. Вы должны обнаружить дважды для каждого состава.
   • Используйте тот же капилляр, чтобы найти тот же раствор на вашей второй пластине TLC. Пятна должны быть не более 2 мм в диаметре. Затем выбросьте капилляр и закройте флакон.
   • Найдите два других раствора на пластинах таким же образом, используя чистые капилляры. Будьте осторожны, чтобы не допустить перекрестного загрязнения растворов. Примечание: Если пятно очень светлое или очень маленькое, подождите, пока оно высохнет, а затем нанесите тот же раствор поверх сухого пятна. Если пятно все еще влажное, капиллярное действие может сделать его слишком широким и разбавленным.
   • Как только вы сделаете три пятна на каждой пластине, выбросьте капилляры и верните пластины обратно в свой капюшон. Держите тарелки ровно, пока они сохнут.
   • Теперь пометьте банку объемом 50 мл "100% гексан" и поднесите банку, ее крышку и мерный цилиндр объемом 10 мл к колпаку для растворителя.
   • Отмерьте 2–3 мл чистого гексана с помощью вашего градуированного цилиндра и налейте его в банку, чтобы заполнить ее на глубину 0,62–0,7 см. Закройте бутылку и банку крышкой и вернитесь в вытяжной шкаф.
   • Пометьте вторую банку объемом 50 мл "60% гексана, 40% этилацетата" и поднесите ее вместе с чистым градуированным цилиндром к колпаку для растворителя. Отмерьте 2–3 мл смеси 60/40 в банку и верните в вытяжной шкаф.
   • Поставьте тарелки рядом с банками, чтобы сравнить взаимное расположение растворителя и пятен. Уровень растворителя должен быть ниже пятен для каждой пластины.
   • Затем возьмите три листа фильтровальной бумаги, положите фильтровальную бумагу вертикально у стены в каждой банке, а затем плотно закройте банки.
   • Инициализируйте каждую пластину над отметкой, чтобы вы могли идентифицировать их позже. Убедитесь, что фильтровальная бумага в банках пропиталась растворителем и что пятна на тарелках полностью высохли.
   • Теперь откройте банку со 100% гексаном и с помощью пинцета аккуратно поместите пластину 100 в банку, удерживая пластину на уровне поверхности растворителя, когда она входит в растворитель. Плотно закройте банку, стараясь не толкать тарелку.
   • Оставьте банку неподвижной, пока растворитель перемещается вверх по тарелке. Развитие в чистом гексане обычно занимает около 7-10 минут. Следите за пластиной, чтобы убедиться, что растворитель не достигает верха.
   • Когда фронт растворителя чистого гексана находится примерно в 1 см от верхней части пластины, извлеките его с помощью пинцета. Положите его на бумажное полотенце силикагелем вверх и быстро отметьте фронт растворителя линией и карандашом поперек тарелки. Оставьте тарелку лежать ровно, пока растворитель испаряется.
   • Поместите другую пластину в элюент 60/40 таким же образом. Подождите, пока фронт растворителя пластины 60/40 окажется примерно в 1 см от верха, а затем извлеките его и быстро отметьте фронт растворителя таким же образом.
   • Как только пластина со 100% гексаном полностью высохнет, поднимите ее пинцетом и поднесите вместе с карандашом к ультрафиолетовой лампе на общем скамейке.
   • Поместите тарелку под лампу и осветите ее ультрафиолетовым светом. Пластина будет светиться зеленым цветом из-за флуоресцентного маркера в слое силикагеля. Темные пятна – это соединения.
   • Тщательно обведите карандашом каждое пятно, даже если оно не продвинулось очень далеко.
   • Затем выключи лампу и поднеси свою тарелку к колпаку для разработки йода. Откройте йодную камеру. С помощью пинцета аккуратно поместите пластину вертикально в йодную камеру, а затем снова накройте камеру.
   • Подождите 3-4 минуты, пока пары йода не останутся в пятнах. Затем достаньте пластину пинцетом, закройте камеру и наметьте коричневые и желтые пятна на пластине. Эти пятна потускнеют, поэтому быстро их отметьте.
   • Визуализируйте сухую пластину 60/40 под ультрафиолетовым светом, а затем с парами йода таким же образом. заметка: Чтобы избежать побочных реакций, всегда проверяйте пластины под воздействием ультрафиолетового излучения, прежде чем подвергать их воздействию йода.
   • Теперь точно скопируйте пятна и фронты растворителя на соответствующие рисунки пластин в вашем лабораторном блокноте. Для каждой пластины измерьте и запишите высоту фронта растворителя относительно стартовой линии.
   • Наконец, измерь расстояние между центром каждого места и его начальной линией и запиши его в свой лабораторный блокнот. Теперь вы можете перейти к следующей части лабораторной работы.
2. Unknown Compound Identification<кнопка class="expand">Expand

   Во второй половине лабораторной работы вы будете использовать TLC, чтобы выяснить, что содержится в неизвестном анальгетике. Он может содержать одно или несколько из этих соединений: аспирин, кофеин и ацетаминофен. Эти соединения обладают высокой поляризацией, поэтому в качестве элюента вы будете использовать готовую смесь из 90% этилацетата и 10% гексана.

   Вы проведете три эталонных соединения и неизвестное на одной пластине. Позже вы будете использовать значения Rf эталонных соединений для идентификации неизвестного. Во-первых, перепроверьте, какой неизвестный материал вам был назначен для анализа, прежде чем начать.

   • Теперь положите чистое бумажное полотенце в капюшон и получите новую пластину TLC. Подготовьте верхнюю отметку и стартовую линию так же, как и раньше. Сделайте на тарелке четыре равномерно расположенных галочки, следя за тем, чтобы внешние отметки находились на расстоянии не менее 0,5 см от краев.
   • Нарисуйте точную копию таблички в своем лабораторном блокноте и обозначьте галочки как 'aspirin', 'acetaminophen', 'caffeine' и 'unknown'.
   • Теперь принеси свою тарелку на общую скамейку. Точечно растворы аспирина, ацетаминофена, кофеина и неизвестного, что вам было присвоено по соответствующим отметкам, с помощью чистого капилляра для каждого раствора. заметка: Когда вы обнаружите неизвестный раствор, не погружайте капилляр слишком глубоко во флакон с раствором, чтобы не закупорить капилляр нерастворимым материалом из неизвестного вещества.
   • Выбросьте капилляры и закройте флаконы, прежде чем возвращать тарелку обратно в вытяжной шкаф. Положите тарелку на бумажное полотенце, чтобы закончить сушку.
   • Затем пометьте чистую банку объемом 50 мл с завинчивающейся крышкой "90% этилацетат, 10% гексан" и поднесите ее в чистом градуированном цилиндре к колпаку для растворителя.
   • Налейте 2–3 мл раствора 90/10 в банку и вернитесь в вытяжной шкаф. Убедитесь, что уровень растворителя будет ниже пятен на пластине. Затем положите в банку чистую фильтровальную бумагу вертикально и плотно закройте ее.
   • Как только пластина TLC высохнет и фильтровальная бумага пропитается, осторожно поместите пластину в растворитель. заметка: При этом очень важно держать тарелку ровно. Если фронт растворителя диагональный, пройденное расстояние растворителя будет разным для каждого пятна, что делает невозможным визуальное сравнение неизвестных и эталонных точек.
   • Подождите, пока фронт растворителя достигнет 1 см от верхней части пластины. Затем достаньте пластину, отметьте ее как лицевую сторону растворителя и дайте ей высохнуть, лежа ровно.
   • Когда пластина высохнет, визуализируйте ее с помощью ультрафиолетового света и в йодной камере, а затем обведите пятна карандашом.
   • Неизвестный материал может быть смесью соединений, поэтому внимательно ищите места на одной линии со всеми тремя опорными точками.
   • Затем точно скопируйте пятна на рисунок пластины в вашем лабораторном блокноте. Измерьте и запишите высоту фронта растворителя и пятна относительно стартовой линии.
   • Когда закончите, достаньте пропитанную растворителем фильтровальную бумагу из банок и дайте ей высохнуть в колпаке.
   • Вылейте остатки растворителей в стандартные органические отходы, вымойте стеклянную посуду обычными методами вашей лаборатории и уберите лабораторное оборудование.
   • Выбросьте использованные пластины TLC в лабораторный мусор или вместе со стеклянными отходами, в зависимости от материала основы.
   • Наконец, как только фильтры высохнут, выбросьте их вместе с остатками мусора.
3. Результаты<кнопка class="развернуть">Развернуть
   • Рассчитайте значения R_f для фенола, бензойной кислоты и бутилфенилового эфира, покрытых 100% гексаном. Для каждого соединения на пластине TLC измерьте расстояние от стартовой линии до центра его точки. Затем разделите это значение на расстояние от стартовой линии до фронта растворителя.
   • Только бутилфениловый эфир переместился на измеримое расстояние от стартовой линии, что согласуется с тем, что он наименее полярен. Для эффективного разделения значения R_f должны отличаться на 0,3 – 0,7. Таким образом, мы можем сделать вывод, что фенол и бензойная кислота слишком полярны, чтобы их можно было эффективно разделить с помощью аполярного растворителя, такого как чистый гексан.
   • Рассчитайте значения R_f для пластины, которую вы использовали в смеси гексана и этилацетата 60/40. Этилацетат является умеренно полярным растворителем, поэтому соединения перемещались дальше и расположены дальше друг от друга на пластине.
   • Порядок разделения показывает, что бензойная кислота, наиболее полярное соединение, имеет наибольшее сродство к силикагелю, в то время как бутилфениловый эфир, наименее полярное соединение, имеет наименьшее сродство к силикагелю. Это согласуется с предположением о том, что менее полярные соединения распространяются дальше в полярных стационарных фазах.
   • Посмотри на свою третью тарелку и рассчитай значения R_f для аспирина, ацетаминофена и кофеина. Кофеин, самый полярный комплекс из трех, перемещался меньше всего. Ацетаминофен путешествовал вторым по дальности, в то время как аспирин, наименее полярный, путешествовал больше всего.
   • Наконец, определите соединения в вашем неизвестном материале, сравнив его пятно или пятна с тремя эталонными точками.