Колоночная хроматография

Источник: Лара Аль Харири и Ахмед Басабрэйн из Массачусетского университета в Амхерсте, штат Массачусетс, США

1. Колоночная хроматография пищевого красителя<кнопка class="развернуть">Развернуть

   В этом эксперименте вы будете использовать колоночную хроматографию для разделения зеленого пищевого красителя на составляющие его синие и желтые красители, называемые эриоглауцином и тартразином. Во-первых, вы будете использовать 95% этанол для элюирования красителя с более слабым сродством к силикагелю. Затем вы смоете водой второй краситель из колонки. Чтобы восстановить очищенные красители, вы будете собирать каждую полосу красителя, когда она покидает колонну. Эти собранные объемы называются дробями.

   • Для начала, наденьте лабораторный халат, защитные очки и пару нитриловых перчаток.
   • Принесите колонку или бюретку в центральную зону снабжения. Возьмите кусок ваты или стекловаты и вдавите его в верхнюю часть колонны. Используйте длинную проволоку или стержень с тупым концом, чтобы надавить на него, чтобы заглушить колонну прямо над запорным краном. заметка: Вата должна быть устойчивой, но не упаковывайте ее слишком плотно, потому что растворитель должен легко проходить через нее. Убедитесь, что запорный кран может свободно вращаться, не зацепляясь за пробку.
   • Прикрепите зажим для бюретки к лабораторному стенду и зажмите колонну вертикально так, чтобы под ней было около 4 дюймов пространства. Убедитесь, что запорный кран закрыт.
   • Пометьте стакан объемом 100 мл как 'отходы' и поместите его под колонку.
   • Затем отмерьте 1 г песка в тарированной лодке для взвешивания и верните ее обратно на стол.
   • Затем отметьте столбец примерно на 0,5 см выше верхней части ватной пробки.
   • Поместите маленькую воронку в верхнюю часть колонны и насыпьте через нее достаточно песка, чтобы над пробкой был слой глубиной 0,5 см. Это предотвратит попадание силикагеля через пробку в ваши фракции.
   • Снимите воронку и осторожно коснитесь столбца, чтобы равномерно распределить песок.
   • Теперь подготовьте свои элюенты. Пометьте стакан объемом 50 мл и мерный цилиндр объемом 50 мл как «вода».
   • Отмерьте 50 мл деионизированной воды с помощью мерного цилиндра и налейте ее в стакан.
   • Затем обозначьте еще один стакан на 50 мл и градуированный цилиндр на 50 мл как "этанол". Отмерьте 50 мл 95% этанола и налейте его в эту мензурку.
   • Теперь приобретите 4 или 5 чистых пипеток Пастера и колбу для пипетки. Аккуратно нанесите пипеткой 7 – 8 мл этанола вдоль внутренних стенок колонки. Этот слой растворителя позволит вам залить эту суспензию силикагеля в колонну, не нарушая песок.
   • Откройте запорный кран и слейте ~1 мл этанола в стакан для отходов, чтобы прокачать воздух из запорного крана и убедиться, что растворитель легко проходит через пробку. Убедитесь, что на песке и пробке нет сухих пятен, и аккуратно постучите по боковой стороне колонки, чтобы удалить застрявшие пузырьки воздуха.
   • Затем поместите чистую воронку в верхнюю часть колонки и пометьте третий стакан объемом 50 мл "суспензия силикагеля в этаноле".
   • Тщательно взвесьте 5 г порошка силикагеля и насыпьте его в стакан с этикеткой.
   • Затем принесите силикагель, стеклянный стержень и ваш цилиндр с этаноловым градуированием к вытяжке для этанола.
   • Отмерьте 18 мл 95% этанола и налейте его в стакан. Перемешайте смесь стеклянным стержнем, пока текстура не станет однородной и не останется сухих пятен или комков порошка. Обычно это занимает ~1 мин. Примечание: Суспензия должна быть густой, как тесто, но она все равно должна легко течь. Если суспензия слишком жесткая, она может засорить воронку или улавливать пузырьки воздуха в колонне.
   • Как только порошок полностью вспылит в этаноле, принесите его на свой стол. Перемешайте кашицу до тех пор, пока ее текстура снова не станет однородной, и сразу же вылейте ее в колонну.
   • Осторожно постучите по стенкам колонки, пока силикагель оседает, чтобы избавиться от пузырьков воздуха.
   • Промойте стакан 1 или 2 мл этанола и вылейте ополаскиватель в колонку. Затем снимите воронку и отложите ее в сторону.
   • Пипетка этанола вдоль внутренней части колонны, чтобы смыть частицы, прилипшие к стенкам. Затем слейте растворитель до тех пор, пока мениск не окажется чуть выше верхней части силикагеля.
   • Теперь используйте мерный цилиндр объемом 5 или 10 мл, чтобы получить около 0,8 мл раствора зеленого пищевого красителя.
   • Используйте чистую пипетку, чтобы аккуратно нанести от 5 до 7 капель раствора красителя равномерно на верхнюю часть силикагеля. При необходимости добавьте несколько капель этанола, чтобы силикагель оставался покрытым.
   • Пока вы ждете, пока краситель впитается, пометьте два чистых стакана объемом 50 мл как "фракция этанола" и "фракция воды". Замените стакан для отходов под колонной на стакан этаноловой фракции.
   • Затем заполните колонку этанолом, пипетируя первый мл вдоль внутренних стенок, чтобы не повредить силикагель.
   • Затем откройте запорный кран наполовину и отрегулируйте его до тех пор, пока уровень растворителя не уменьшится на ~1 мл каждые 15 – 20 секунд.
   • Периодически пополняйте колонку, чтобы этанол продолжал течь. Следите за тем, чтобы над силикагелем всегда находился не менее 1 см растворителя.
   • Следите за желтыми и синими полосами, когда они разделяются. заметка: Если вам нужно отойти в сторону, закройте запорный кран, чтобы колонна не высохла, пока вас нет. Не останавливайтесь более чем на 1 минуту, так как составные полосы начнут расширяться. Обычно требуется около 20 – 35 минут, чтобы быстро движущийся краситель покинул колонку.
   • Как только вы соберете весь быстро движущийся краситель в стакане с этаноловой фракцией, закройте запорный кран, отложите этаноловую фракцию в сторону и положите стакан для отходов под колонну.
   • Слейте растворитель до тех пор, пока мениск не окажется чуть выше верхушки силикагеля. Затем замените стакан для отходов на стакан водной фракции.
   • Используйте чистую пипетку, чтобы заполнить верхнюю часть колонки деионизированной водой. Затем откройте запорный кран ровно настолько, чтобы вода стекала через колонну со скоростью около 1 мл каждые 15 – 20 с.
   • Заполняйте колонку водой по мере необходимости, пока вторая цветная полоса полностью не покинет колонку. Обычно это занимает еще 15 – 25 минут. Затем закройте запорный кран и замените стакан водной фракции на стакан для отходов.
   • Теперь полностью осушите колонку и оставьте запорный кран открытым.
   • Записывай цвета этаноловых и водных фракций в свой лабораторный блокнот.

     Таблица 1: Колоночная хроматография пищевого красителя

     	Цвет	Объем (мл)
     Фракция этанола
     Водная фракция

     Нажмите здесь, чтобы скачать таблицу 1
   • Налейте фракции в соответствующие градуированные цилиндры объемом 50 мл и запишите объем каждой фракции. Затем закройте запорный кран и подведите колонну к вытяжному шкафу.
   • Зажмите колонну вертикально в капюшоне, чтобы силикагель мог высохнуть. Ваш инструктор либо расскажет вам, как чистить колонку, либо позаботится о ней после лабораторной работы.
   • Теперь смойте собранные фракции и остатки этанола, воды и раствора красителя в канализацию и очистите остальную стеклянную посуду, как обычно.
   • Выбросьте использованные пипетки Пастера в стеклянные отходы. Выбросьте использованные бумажные полотенца и лодку для взвешивания в мусорное ведро лаборатории и очистите столешницу перед уходом.
2. Результаты<кнопка class="развернуть">Развернуть

   В этом эксперименте вы увидели, что этанол своевременно элюирует синий эриоглауцин, но он не является эффективным элюентом для желтого тартразина. Бумажная хроматография зеленого красителя показывает аналогичные результаты. Таким образом, мы приходим к выводу, что эриоглауцин имеет более низкое сродство к силикагелю, чем тартразин.

   Теперь рассмотрим преимущества использования двух растворителей для раздельного элюирования красителя. Вода более полярна, чем этанол, поэтому мы предполагаем, что она будет разбавлять оба красителя быстрее, чем только этанол. Хотя вы также использовали бы меньше растворителя в целом, если бы использовали только воду, разделение было бы хуже, что затруднило бы сбор чистых фракций.

   В качестве альтернативы, вы могли бы продолжать использовать этанол после того, как собрали эриоглауцин, но потребовалось бы много времени и много этанола, чтобы вымыть тартразин таким образом. Переключение элюента на воду после элюирования эриоглауцина сэкономило время и свело к минимуму потери растворителя без ущерба для чистоты.