УФ-ВИД спектроскопия красителей

Lab Manual
Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Lab Manual Chemistry

UV-Vis Spectroscopy of Dyes

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Previous Video

2.30: Identification of Unknown Aldehydes and Ketones

Next Video

2.32: Identifying Alcohols

144,738 Views

•

04:55 min

•

March 26, 2020

Абсорбция

Когда свет взаимодействует с веществом, часть света поглощается, в то время как остальная часть либо отражается, либо пропускается через него. Вещества, которые мы воспринимаем как имеющие цвет, отражают свет в видимом диапазоне. Цвет вещества, которое мы можем видеть, зависит от того, какая длина волны света отражена. Вещество, которое мы воспринимаем как синий, отражает свет в синем диапазоне (430 – 480 нм) видимого спектра. Согласно цветовому кругу, одно и то же вещество поглощает свет, который дополняет отраженный свет. Так, синее вещество поглощает свет в оранжевой области (590 – 630 нм) видимого спектра. Не все соединения поглощаются в видимой области, и в результате они кажутся человеческому глазу бесцветными.

Свет определяется его энергией E и длиной волны λ. Здесь h — постоянная Планка, а c — скорость света.

Длина волны света обратно пропорциональна его энергии. Таким образом, свет с более высокой энергией имеет более короткую длину волны.

Красителей

Красители разных цветов различаются по длине волны света, который они поглощают. Большинство красителей представляют собой сопряженные соединения с чередующимися двойными и одинарными связями и обычно поглощают свет в видимой области.

Сопряженная часть молекулы красителя может быть очень короткой, что означает, что существует низкая степень конъюгации и небольшое количество чередующихся двойных и одинарных связей, или длинной, что означает, что существует высокая степень конъюгации с большим количеством чередующихся двойных и одинарных связей. Эти чередующиеся двойные связи не обязательно должны находиться только между двумя атомами углерода. Эти сопряженные связи могут включать карбонильные группы и двойные связи между углеродом и кислородом. Степень сопряжения определяет длину волны света, поглощаемого соединением. Например, соединения с высокой степенью конъюгации поглощают большую длину волны, чем соединения с меньшей степенью сопряжения.

Согласно теории молекулярных орбиталей, делокализованные электроны занимают молекулярные орбитали. Самая высокая занимаемая молекулярная орбиталь, или HOMO, является орбиталью с самой высокой энергией с электроном. Самая низкая незанятая молекулярная орбиталь, или LUMO, является орбиталью с самой низкой энергией без электрона. Молекулы с малой конъюгацией или без нее обычно имеют большой энергетический разрыв между HOMO и LUMO. Однако сопряженные молекулы имеют меньший энергетический разрыв между HOMO и LUMO.

Чтобы возбудить электрон с более низкого энергетического уровня на более высокий, или с HOMO на LUMO, молекула должна поглощать свет с энергией, равной энергетическому разрыву между двумя орбиталями. По этой причине молекулам с большим энергетическим зазором требуется свет более высокой энергии, такой как ультрафиолетовый свет, чтобы возбудить электрон. Красители, однако, имеют меньшую энергетическую щель и требуют света с более низкой энергией, такой как видимый свет, чтобы возбудить электрон.

По этой причине молекулам с большим энергетическим зазором требуется свет более высокой энергии, такой как ультрафиолетовый свет, чтобы возбудить электрон. Красители, однако, имеют меньшую энергетическую щель и требуют света с более низкой энергией, такой как видимый свет, чтобы возбудить электрон.

Вспомним, что энергия света обратно пропорциональна длине волны. Таким образом, свет с более высокой энергией имеет более короткую длину волны, чем свет с более низкой энергией, который имеет более длинную длину волны.

спектрофотометр

Экспериментально поглощение света измеряется с помощью спектрофотометра UV-Visible (UV-Vis). В этом приборе используется источник света, который преобразуется монохроматором в определенные длины волн света, которые проходят через образец и попадают в детектор на другом конце. Образцы должны находиться в жидкости, поэтому растворитель требуется, если органическое соединение является твердым. Этот раствор хранится в держателе для образцов, известном как кювета. В зависимости от образца кювета может быть изготовлена из кварцевого кристалла, стекла или пластика и иметь определенную длину пути. Эта длина пути — это расстояние, которое свет должен пройти через образец. Поскольку растворитель также поглощает свет, требуется образец только растворителя. Таким образом, когда прибор захватывает спектр поглощения образца соединения, он может вычесть фоновый спектр растворителя, чтобы отобразить поглощение, вызванное только образцом. Коэффициент пропускания, Т, — это доля исходного света, проходящего через образец.

Здесь P₀ — это излучение, или энергия в секунду на единицу площади светового луча до попадания в образец. P — излучение светового луча, попадающего на детектор. P обычно ниже P₀, так как часть света поглощается образцом.

Поглощение, А, определяется как отрицательный логарифм коэффициента пропускания.

Абсорбция имеет диапазон значений от 0 (отсутствие поглощения) до 2 (поглощение 99%). Когда свет не поглощается, P₀ равно P, а коэффициент пропускания равен единице. Таким образом, поглощение равно нулю. Если поглощается 90% света, то пропускается 10% и T равно 0,1. В результате поглощение равно 1. Если поглощается 99% света, то пропускается 1% (T=0,01), а поглощение равно 2.

Полученный спектр представляет собой график зависимости поглощения от длины волны. Для УФ-ВИД спектрофотометра этот диапазон составляет от 200 до 800 нм.

Закон Бир-Ламберта

Коэффициент пропускания и поглощения того или иного соединения связан с концентрацией соединения в растворе. Эта взаимосвязь описывается законом Бера-Ламберта.

Поглощающая способность образца равна произведению концентрации соединения, длины пути и молярного коэффициента затухания. Этот коэффициент уникален для каждого соединения и будет варьироваться в зависимости от длины волны. Однако, если длина волны остается постоянной, молярный коэффициент затухания будет одинаковым независимо от изменения концентрации. Длина волны, которая соответствует наибольшему поглощению образца, известному как λ_max, также будет иметь наибольший молярный коэффициент затухания.

Ссылки

Silberberg, M.S. (2012). Химия: молекулярная природа материи и изменения. Бостон, Массачусетс: Макгроу Хилл.
Harris, D.C. (2015). Количественный химический анализ. Нью-Йорк, Нью-Йорк: W.H. Freeman and Company.

Transcript

Когда свет достигает вещества, часть поглощается им, в то время как остальная часть либо отражается, либо пропускается через него. Цвет вещества, как мы его воспринимаем, зависит от того, какие длины волн оно, скорее всего, будет отражать. Например, кусок ткани, который мы видим синим, содержит краситель, который сильно отражает синий свет и сильно поглощает оранжевый и красный свет.

Красители обычно представляют собой сопряженные соединения, что означает, что они имеют чередующиеся двойные и одинарные связи. Электроны могут свободно перемещаться внутри сопряженной системы. Красители разного цвета должны различаться по длине волны света, который они поглощают. Когда мы рассмотрим несколько примеров, мы увидим, что поглощенная длина волны увеличивается с величиной сопряжения.

Итак, как длина волны связана со степенью сопряжения? Рассмотрим молекулярные энергетические уровни. Делокализованные электроны можно рассматривать как занимающие молекулярные орбитали, или МО. Молекула поглощает свет с точной энергией, необходимой для возбуждения электрона до молекулярной орбитали с более высокой энергией. Наиболее вероятным является переход от самой высокой занятой молекулярной орбитали, называемой HOMO, к самой низкой незанятой молекулярной орбитали, или LUMO. Таким образом, мы ожидаем, что наиболее поглощенная длина волны соответствует энергетическому разрыву HOMO – LUMO.

Молекулы с малой конъюгацией или без нее обычно имеют большой разрыв между HOMO и LUMO. Они поглощают ультрафиолетовый свет и отражают весь видимый свет, поэтому кажутся белыми или бесцветными. Сопряженные связи стабилизируют молекулы, снижая их энергетический уровень, особенно при высоких энергиях. Чем выше степень сопряжения, тем меньше зазор между HOMO и LUMO и тем больше поглощаемая длина волны. Металлы и замены также влияют на зазор.

Давайте рассмотрим на примере. Ретинол имеет небольшую сопряженную систему, в то время как хлорофилл А имеет большую систему с азотом и магнием. Ретинол поглощается при длине волны 325 нм, в то время как хлорофилл а поглощается при длине волны 430 и 662 нм. Как и ожидалось, энергетический разрыв ретинола больше.

Мы можем изучить поглощение с помощью УФ- и видимого света, или УФ-ВИД спектрофотометра. Спектрофотометр состоит из источника света, устройства для управления длинами волн, которые получает образец, и детектора света. Образец обычно представляет собой прозрачный раствор. Поглощение может быть измерено на определенной длине волны или измерено в диапазоне длин волн, поскольку соединения часто поглощают на более чем одной длине волны. Кроме того, мы видим диапазон длин волн для каждого перехода, потому что молекулы находятся в разных ориентациях и вибрационных состояниях.

Во время измерения свет либо поглощается, либо проходит сквозь него, не соприкасаясь с молекулами, либо отражается от молекулы растворителя или соединения. Мы игнорируем небольшое количество света, которое отражается назад. Иногда свет, который мог бы быть поглощен молекулой, вместо этого отражается от нее. Мы описываем, насколько хорошо вещество пропускает определенную длину волны с уникальным молярным коэффициентом затухания. В то время как абсорбция изменяется с концентрацией, коэффициент затухания моляров не меняется.

После измерения спектрофотометр сравнивает полученный и исходный свет в соотношении, называемом коэффициентом пропускания. Поглощение представляет собой отрицательное основание 10 логарифм пропускания. Если спектрофотометр имеет поглощение растворителя, он вычитает его, чтобы показать только соединение. Результаты обычно отображаются в виде зависимости поглощения от длины волны. Длина волны, на которой соединение поглощает больше всего, называется лямбда макс. Если бы мы рассчитали молярный коэффициент затухания для каждой длины волны, он был бы самым высоким при макс

Молярный коэффициент затухания, поглощение, концентрация образца и длина пути, которая представляет собой расстояние, на которое свет прошел через образец, связаны законом Бера-Ламберта. Если мы знаем любые три переменные, мы можем вычислить четвертую.

В этой лаборатории вы проанализируете характеристики поглощения флуоресцеина, бета-каротина и красителя индиго с помощью УФ-ВИД спектрофотометра. Затем вы будете использовать закон Бера-Ламберта для создания калибровочной кривой β-каротина, а затем определите концентрацию раствора β-каротина.