7.9: Перезапуск остановленных вилок репликации

Репликация ДНК инициируется в участках, содержащих заранее определенные последовательности ДНК, известные как точки начала репликации. ДНК раскручивается в этих участках с помощью геликазы поддержания минихромосомы (MCM) и других факторов, таких как Cdc45 и связанного с ним комплекса GINS. Раскрученные одиночные цепи защищены репликационным белком А (RPA) до тех пор, пока ДНК-полимераза не начнет синтезировать ДНК на 5'-конце. цепи в том же направлении, что и репликационная вилка. Чтобы предотвратить развал репликационной вилки, вместе с растущей вилкой перемещается комплекс защиты вилки (FPC). Этот консервативный белковый комплекс можно найти у эукариот и состоит из таких белков, как Tim, Tipin, And1 и Claspin.

В лаборатории репликационные вилки могут быть остановлены под действием гидроксимочевины. Гидроксимочевина истощает клеточные пулы dNTP, которые необходимы ДНК-полимеразе для синтеза ДНК. Когда dNTP недоступны, синтез ДНК замедляется и в конечном итоге полностью прекращается. Таким образом, остановка репликационных вилок в живых клетках связана с неактивностью ДНК-полимеразы.

FPC связывает активность полимеразы с активностью хеликазы. Таким образом, даже когда полимераза останавливается, хеликаза продолжает раскручивать ДНК, производя избыток одноцепочечной ДНК (оцДНК), прежде чем остановиться. Эта избыточная оцДНК напоминает резецированные выступы в результате репарации двухцепочечных разрывов. Чтобы стабилизировать структуру, белки RPA связываются с оцДНК и привлекают белки ATR. Связывание ATR активирует белок-регулятор клеточного цикла Chk1, чтобы блокировать запуск источников репликации и останавливать клеточный цикл для восстановления ДНК. Таким образом, оцДНК служит мощным сигналом, связывающим повреждение ДНК с восстановлением.

При остановке вилки репликации, ДНК-полимеразы останавливает синтез зарождающейся ДНК. Но геликаза продолжает разматывать двухцепочечную ДНК ещё немного, прежде чем отмежеваться. Далее, Белок репликации A или RPA, связывает и защищает эту избыточную одноцепочечную ДНК на заглохшей вилке.

Кодированная с RPA одноцепочечная ДНК затем рекрутирует Rad9-Rad1-Hus1, или комплекс 9-1-1, который в свою очередь Включает привязку ATR. Скрепление ATR запускается Фосфорилированием Chk1. И Chk1, в свою очередь, фосфорилирует Фосфатазу Cdc25.

Фосфорилирование означает это Cdc25 не может принять далее фосфаты из клетка Белок-регулятор Cdk1. Таким образом, Cdk1 остается неактивным, и цикл клетка приостановлен. Затем, перед началом ремонта, рекомбинационный белок, Rad51 заменяет RPA одноцепочечной ДНК.

Затем, чтобы запустить реверсирование вилки, Rad51 загружает фермент, SMARCAL1, на ДНК, который действует как рекомбинатор геликаза, и склеивает вновь синтезированные цепи вместе и образуют четырехсторонний узел связи, который напоминает куриную лапку. Этот процесс называется регрессия вилки. Существует два способа устранить регрессию вилки.

В первом BRCA2 стабилизирует Ядерной филамент Rad51 между пальцами куриной ножки и защищает ремоделированную вилку от деградации нуклеазами. Зарождающаяся отстающая цепь может служить шаблоном для расширения ведущей цепи, таким образом, обходя пораженные участки на родительской ветви. И, наконец, SMARCAL1 меняет направление вилки регрессии путем рекомбинации родительской цепи.

В этом случае очаг поражения остается в родительской цепи но переключатель шаблона позволяет реплицированной ДНК оставаться нетронутой. Второй путь урегулирования регрессии вилки Происходит при отсутствии BRCA2. На этот раз, четырёхстронний узел куриная лапка"расслаивается зависящей от структуры эндонуклеаза, Mus81, в комплексе с эндонуклеазой узла, Mms4.

Расслоение генерирует двухцепочечные разрывы, который могут быть отремонтированы гомологичной рекомбинацией.