7.16: Консервативная сайт-специфическая рекомбинация и изменение фазы

Поскольку сегменты ДНК разрезаются и реорганизуются зависимым от направления образом, сайт-специфическая рекомбинация стала эффективным методом генной инженерии. Рекомбиназы Flippase и Cyclization, или Flp и Cre, соответственно, являются двумя членами семейства тирозин-рекомбиназ, полученными из бактериофагов, которые используются для обеспечения сайт-специфических вставок, делеций и целевой экспрессии белков в линиях клеток млекопитающих.

Сайты распознавания рекомбиназы Cre, называемые сайтами LoxP, имеют длину около 34 пар оснований. Сайты LoxP содержат палиндромные последовательности из 13 п.н., что означает, что нуклеотидная последовательность читается одинаково как в 5’-к-3’, так и в 3’-к-5’ направлениях. Сайт-специфическая рекомбинация, опосредованная Cre-рекомбиназами, является одним из самых популярных методов, используемых при создании трансгенных мышей с приобретенными мутациями. Использование термостабильных вариантов рекомбиназы Cre с тканеспецифическими промоторами позволяет осуществлять пространственный контроль над экспрессией и действием рекомбиназы Cre. Например, размещение специфичного для почек промотора кадгерина перед геном Cre позволяет ферменту экспрессироваться только в почечных тканях. Для временного контроля активности Cre-рекомбиназы ген фермента сливается с лиганд-связывающим доменом, так что фермент экспрессируется только в присутствии конкретного лиганда.

Основным ограничением использования сайт-специфической рекомбинации в качестве инструмента редактирования генома является то, что сайт или сайты, являющиеся целью рекомбинации, должны быть сначала вставлены или должны присутствовать случайно. Если геномный сайт, совпадающий с сайтом распознавания фермента, может быть предварительно выбран, могут быть использованы рекомбиназы с “изготовленной на заказ” целевой специфичностью. Недавние исследования использовали мутагенез и перетасовку генов для создания вариантов Flp, которые могут эффективно распознавать сайты с комбинаторными мутациями. Это многообещающие результаты для будущих итераций перетасовки генов, которые могут дать более специфические варианты Flp и могут быть коммерчески использованы в качестве молекулярного инструмента для создания больших геномов.