FISH – флуоресцентная гибридизация in-situ

Флуоресцентная гибридизация in situ или FISH — это метод, используемый для обнаружения расположения определенных генов или частей генов на хромосомах в фиксированных клетках.

В этом методе флуоресцентно меченая одноцепочечная ДНК используется в качестве зонда для связывания частей хромосом, содержащих комплементарную последовательность ДНК, называемых мишенью.

Во-первых, клетки задерживаются в интерфазе или метафазе. Арестованные клетки суспензируют в буферном растворе и выкладывают на чистое предметное стекло.

Затем целевая ДНК и помеченные зонды денатурируются с помощью тепла или химических веществ. На этом этапе двухцепочечная ДНК отделяется, оставляя зонд и целевую ДНК в виде одноцепочечных последовательностей, способных к спариванию оснований.

Затем зонд и целевую ДНК смешивают вместе и инкубируют в течение ночи. Это позволяет зонду гибридизоваться с его комплементарной последовательностью на хромосомах.

После завершения гибридизации излишки зонда смываются.

Если зонд был помечен флуорофором, места расположения гибридизированной ДНК можно непосредственно визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа.

В противном случае гибридизованная ДНК должна быть флуоресцентно помечена перед визуализацией. Для этого последовательность зонда должна содержать модифицированный нуклеотид, связанный с гаптеном – небольшой молекулой, к которой флуорофор, например, флуоресцентное антитело, может прикрепляться.

Такая прямая визуализация генов очень полезна для клеточных диагностических анализов, где генетические аномалии могут быть обнаружены в результате любой потери..., приобретения..., или перегруппировки хромосом во время деления клетки.