Секвенирование по Сэнгеру

Для некоторых экспериментов или диагнозов может потребоваться получение нуклеотидной последовательности всего генома организма, чтобы получить более глубокое понимание присутствующих генов или аллелей, их функций и связанных с ними заболеваний. Этого можно достичь с помощью секвенирования ДНК.

Двумя известными традиционными методами секвенирования ДНК являются метод секвенирования по Сэнгеру и метод Максама-Гилберта.

При секвенировании по Сэнгеру, также известном как терминирование цепи или секвенирование дидезоксинуклеотидов, чистая матричная ДНК, подлежащая секвенированию, амплифицируется ПЦР в присутствии соответствующих праймеров, dNTP и модифицированных оснований, называемых дидезоксинуклеотидами или ddNTP.

У дидезоксинуклеотидов отсутствует гидроксильная группа дезоксинуклеотидов, что ограничивает их способность образовывать фосфодиэфирные связи с соседними нуклеотидами.

Каждый дидезоксинуклеотид также помечен отдельной флуоресцентной меткой, чтобы облегчить его обнаружение.

Первым шагом является денатурация матричной ДНК в одноцепочечную ДНК.

Затем, когда праймеры связываются с интересующей областью, ДНК-полимераза начинает добавлять новые нуклеотиды к цепи ДНК и иногда включает дидезоксинуклеотид вместо дезоксинуклеотида, что приводит к прекращению амплификации ДНК.

В результате получаются фрагменты ДНК разной длины, каждый из которых заканчивается меченым дидезоксинуклеотидом.

Затем эти фрагменты ДНК помещаются в капиллярный гель, чтобы разделить их по размеру, и спектры излучения от каждого из этих фрагментов анализируются с помощью автоматизированного программного обеспечения для расшифровки генетической последовательности желаемой ДНК.