16.12: Гибридизация in-situ

Гибридизация in situ (ISH) — это метод, используемый для обнаружения и локализации специфических молекул ДНК или РНК в клетках, тканях или срезах тканей с помощью меченого зонда. Метод был впервые использован в 1969 году для исследования нуклеиновых кислот. В настоящее время он является важным инструментом в научных исследованиях и клинических условиях, особенно в диагностических целях.

Типы щупов и этикеток

Зонд — это комплементарная цепь ДНК или РНК, которая связывается с соответствующими нуклеотидными последовательностями в клетке. В гибридизации in situ используется множество различных зондов, таких как одноцепочечные ДНК-зонды, двухцепочечные ДНК-зонды, антисмысловые РНК-зонды или рибозонды, а также синтетические олигодезоксинуклеотидные зонды. Выбор зонда зависит от нескольких факторов, в том числе от их чувствительности, специфичности, стабильности и легкости проникновения в образец ткани.

Эти зонды могут быть помечены радиоизотопами, флуоресцентными красителями или другими молекулами антигена для целей обнаружения. ³H, ³⁵S и ³²P являются широко используемыми радиоактивно мечеными зондами, в то время как нерадиоактивные метки включают биотин, дигоксигенин и флуоресцеин. Эти метки могут быть прикреплены к молекуле ДНК зонда с помощью методов мечения на концах, ник-трансляции или синтеза случайных праймеров. Методы обнаружения, такие как авторадиография, флуоресцентная микроскопия или иммуногистохимия, используются для визуализации мишени на основе метки, прикрепленной к гибридизованному зонду.

Преимущества и недостатки гибридизации in situ

Одним из основных преимуществ гибридизации in situ является то, что ее можно применять даже к замороженным тканям, что позволяет максимально использовать ткани, которые трудно получить. Кроме того, его можно сочетать с другими методами, такими как иммуногистохимия, для обнаружения белка и активной мРНК в образце. Однако при работе с образцами с низким содержанием копий ДНК и РНК может быть трудно идентифицировать мишени с помощью гибридизации in situ.