16.13: Иммунопреципитация хроматина - ChIP

Иммунопреципитация хроматина, или ChIP, представляет собой метод на основе антител, используемый для идентификации участков на ДНК, которые связываются с интересующими транскрипционными факторами или гистоновыми белками. Это также помогает определить тип модификаций гистонов, таких как ацетилирование, фосфорилирование или метилирование.

Виды ChIP

ChIP можно разделить на два типа – X-ChIP и N-ChIP. X-ChIP включает в себя перекрестное связывание гистонов и регуляторных белков с ДНК in vivo, фрагментацию ДНК путем обработки ультразвуком и выделение комплексов белок-ДНК путем иммунопреципитации их специфическими антителами. С другой стороны, N-ChIP не предполагает сшивания ДНК с белками, а расщепление осуществляется с помощью нуклеаз.

Последующий анализ взаимодействия ДНК и белка

После выделения интересующей ДНК для анализа можно использовать такие методы, как ПЦР, микрочипы или Саузерн-блоттинг. Альтернативно, эту ДНК можно использовать для глубокого секвенирования, известного как ChIP-Seq. ChIP можно модифицировать с использованием других методологий для различных анализов, таких как ChIA-PET, метод, который сочетает в себе принципы ChIP с захватом конформации хромосом для обнаружения дальних взаимодействий хроматина, опосредованных интересующим белком; enChIP, метод, который использует систему CRISPR/Cas9 для нацеливания на определенные области генома и RIP-ChIP/RIP-Seq, модификацию ChIP, используемую для анализа взаимодействий белок-РНК.

Сравнение N-ChIP и X-ChIP

N-ChIP и X-ChIP имеют свои преимущества и недостатки. N-ChIP приводит к более сильному связыванию антител и эффективной и высокоспецифичной иммунопреципитации. Однако N-ChIP подходит только в случае прочно связанных белков, таких как гистоны, поскольку факторы транскрипции могут отсоединяться во время процессинга. Кроме того, не весь расщепленный нуклеазой хроматин растворяется, что приводит к потере определенных фракций образца. X-ChIP — отличный метод для изучения факторов транскрипции, которые не связаны прочно с ДНК из-за стадии перекрестного сшивания. Анализ X-ChIP также более чувствителен, чем N-ChIP, и требует меньшего количества образцов, а также антител. Недостатки X-ChIP включают возможную сложность фрагментации из-за избыточного сшивания и ложноположительных результатов из-за перекрестного сшивания взаимодействий временных белков ДНК.

Иммунопреципитация хроматина, сокращенно ChIP, является методом изучения белково-ДНК-взаимодействий, которые регулируют экспрессию генов.

У эукариот ДНК оборачивается вокруг белков гистонов и образует комплекс, известный как нуклеосома, который в дальнейшем группируется в структуру, известную как хроматин, чтобы помочь плотной упаковке ДНК в клетках.

Экспрессия генов регулируется с помощью модификаций гистонов, которые разматывают или ужесточают эти структуры, а также белков, которые связываются с цис-регуляторными областями ДНК.

В ChIP хроматин расщепляется, и антитела, которые связываются с модификациями гистонов или регуляторными белками, используются для выделения молекул-мишеней с ассоциированной ДНК.

Первым шагом в этом процессе является сшивание белка с ДНК с помощью сшивающего агента, такого как формальдегид. Это обездвиживает белок на ДНК, обозначая место связывания белка. После сшивки хроматин механически разрезается на короткие фрагменты в диапазоне от 100 до 200 пар оснований. Этот процесс известен как X-ChIP.

Альтернативным методом является N-ChIP, при котором нуклеазы непосредственно переваривают ДНК из хроматина в короткие фрагменты, без какой-либо предварительной сшивки.

Иммунопреципитация осуществляется путем введения антител, нацеленных на регуляторные белки в растворе, содержащем срезанную или переваренную ДНК. Эти антитела связаны с агентами, которые помогают в селективной изоляции.

Одним из распространенных методов является связывание антител с магнитными шариками. Магнит используется для выделения антител вместе с любыми связанными молекулами.

Комплекс промывается, чтобы смыть любые слабо связанные загрязнения. Целевые молекулы отделяются с помощью моющего средства, такого как SDS.

В случае X-ChiP сшивание обращается вспять с помощью повышенных температур, а связанные с ним регуляторы или гистоны разрушаются с помощью протеаз, оставляя позади ДНК.

Секвенирование ассоциированной ДНК может помочь идентифицировать цис-регуляторную последовательность, с которой был связан интересующий белок, или ген, экспрессия которого модулируется определенной модификацией гистона.