16.15: Профилирование рибосом

Профилирование рибосом или рибосеквенирование — это метод глубокого секвенирования, позволяющий получить снимок активной трансляции в клетке. Он выборочно секвенирует мРНК, защищенные рибосомами, чтобы получить представление о трансляционном ландшафте клетки в любой момент времени.

Применение профилирования рибосом

Профилирование рибосом имеет множество применений, включая мониторинг трансляции внутри определенного органа или типа ткани in vivo и количественную оценку уровней синтеза новых белков.

Этот метод помогает идентифицировать транслированные открытые рамки считывания и обнаруживать новые транслируемые продукты, включая короткие пептиды и изоформы охарактеризованных белков с неизвестными функциями. Профилирование рибосом также помогает идентифицировать несколько мРНК в клетке, которые не транслируются до тех пор, пока не получат внешний сигнал.

Технические проблемы профилирования рибосом

Профилирование рибосом сталкивается со многими техническими проблемами, такими как потребность в большом количестве образцов, зависимость от своевременного ингибирования трансляции и загрязнение РНК.

Метод мгновенного замораживания может решить проблему быстрого ингибирования трансляции. Он помогает эффективно улавливать распределение рибосом внутри клеток по сравнению с ингибиторами элонгации трансляции, такими как циклогексимид.

Рибосомальная РНК (рРНК), которая связывается с мРНК, обычно удаляется во время профилирования рибосом. Однако иногда некоторые примеси рРНК все же наблюдаются. Для уменьшения загрязнения рРНК исследователи используют фермент дуплекс-специфической нуклеазы (DSN), выделенный из гепатопанкреаса камчатского краба, который расщепляет дцДНК и гибриды ДНК-РНК. Этот метод также часто используется для нормализации библиотек кДНК перед секвенированием следующего поколения и исчерпанием рРНК из библиотек РНК-секвенирования.

Еще одним ограничением профилирования рибосом является анализ данных, который требует соответствующих знаний в области биоинформатики. Для решения этой проблемы используется пакет RriboSeqR, который предоставляет методы для разрешения данных профиля рибосом для нескольких образцов.

Идентификация областей генома, которые транскрибируются и транслируются в белки, является жизненно важным шагом в понимании генома и его экспрессии.

Это достигается с помощью метода, называемого рибосомным профилированием, также называемого рибо-секвенированием. Он отображает положение рибосом на мРНК и идентифицирует мРНК, которые активно транслируются в белки.

Чтобы изолировать РНК, клетки сначала должны быть лизированы, чтобы получить доступ к молекулам внутри них. Затем лизат обрабатывают РНКазами. Эти ферменты расщепляют мРНК, которые не покрыты рибосомами, оставляя только защищенные фрагменты мРНК.

Затем защищенные рибосомами фрагменты отделяются от незащищенных, расщепленных фрагментов с помощью градиента сахарозы.

Затем рибосомы удаляются из фрагментов мРНК, и РНК преобразуется в ДНК методом ОТ-ПЦР с использованием фермента обратной транскриптазы.

Затем ДНК секвенируется и картируется на референсном геноме. Это определяет точное расположение рибосомы вдоль каждой мРНК.

Профилирование рибосом также может помочь идентифицировать нераспознанные открытые рамки считывания или ORF. ORF — это участок ДНК между стартовым кодоном и стоп-кодоном, который может быть транслирован в белок. Обнаружение ORF может быть полезным для идентификации новых генов.

Рассмотрим изучение паттернов экспрессии генов в клеточной линии млекопитающих. Экспериментальная процедура включает в себя воздействие на клетки стимулов, которые могут включить экспрессию генов и инициировать синтез мРНК.

МРНК, которые активно транслируются, идентифицируются с помощью профилирования рибосом.

Этот эксперимент показывает, что ген В транслируется, а гены А и С — нет.

Это также показывает, что дополнительный небольшой участок генома длиной около ста нуклеотидов активно транслируется.

Эта нераспознанная область представляет собой открытую рамку считывания, которая может кодировать новый белок, который активируется экспериментальными стимулами.