16.15: Профилирование рибосом

Рибосомное профилирование или рибосеквенирование — это метод глубокого секвенирования, который позволяет получить снимок активной трансляции в клетке. Он селективно секвенирует мРНК, защищенные рибосомами, чтобы получить представление о ландшафте трансляции клетки в любой момент времени.

Применение рибосомного профилирования

Профилирование рибосом имеет множество применений, в том числе для мониторинга трансляции в определенном органе или типе ткани in vivo и количественной оценки новых уровней синтеза белка.

Этот метод помогает идентифицировать транслируемые открытые рамки считывания и обнаруживать новые транслируемые продукты, включая короткие пептиды и изоформы характеризуемых белков с неизвестными функциями. Профилирование рибосом также помогает идентифицировать несколько мРНК в клетке, которые не транслируются до тех пор, пока они не получат внешний сигнал.

Технические проблемы профилирования рибосом

Профилирование рибосом сталкивается со многими техническими проблемами, такими как потребность в большом количестве образцов, надежность своевременного ингибирования трансляции и загрязнение РНК.

Метод мгновенной заморозки может решить проблему быстрого торможения перевода. Он помогает эффективно улавливать распределение рибосом в клетках по сравнению с ингибиторами удлинения трансляции, такими как циклогексимид.

Рибосомная РНК (рРНК), которая связывается с мРНК, обычно удаляется во время профилирования рибосом. Тем не менее, иногда некоторые контаминанты рРНК все же наблюдаются. Исследователи используют фермент дуплекс-специфическую нуклеазу (DSN) для снижения загрязнения рРНК, выделенной из гепатопанкреасов камчатского краба, которые расщепляют дцДНК и гибриды ДНК-РНК. Этот метод также часто используется для нормализации библиотек кДНК перед секвенированием следующего поколения и исчерпанием рРНК из библиотек РНК-секвенирования.

Еще одним ограничением профилирования рибосом является анализ данных, что требует соответствующих знаний в области биоинформатики. Для решения этой проблемы используется пакет R riboSeqR, который предоставляет методы разрешения данных рибосомного профилирования для нескольких образцов.