Равновесная константа связывания и прочность связи

Константа равновесного связывания (KbK_b) количественно определяет силу взаимодействия белок-лиганд. K_b можно рассчитать следующим образом, когда реакция находится в равновесии:

где P и L — несвязанный белок и лиганд соответственно, а PL — комплекс белок-лиганд.

Поскольку количество связанного лиганда также связано со скоростью связывания лиганда, в экспериментах можно также определить KbK_b, исследуя скорости ассоциации белок-лиганд (konk_on) и диссоциации (koffk_off), используя следующее соотношение:

Таким образом, для определения равновесной константы связывания используются две категории анализов связывания: те, которые измеряют равновесные концентрации, и те, которые измеряют кинетику реакции. В этом случае реакция должна находиться в равновесии во время измерения.

Метод определения равновесных концентраций зависит от желаемой чувствительности и простоты обнаружения сигнала. По этим причинам наиболее широко используются спектроскопические анализы. В этих экспериментах реакция вызывает изменение оптической плотности реагента или продукта при заданной длине волны, которое можно обнаружить с помощью УФ-ВИД-спектрофотометра. Альтернативно, реагент или продукт могут быть помечены флуоресцентным зондом или могут содержать собственный флуорофор. Затем ход реакции можно измерить по изменению флуоресценции. Эти анализы проводятся путем изменения концентрации одного реагента, в то время как остальная часть эксперимента остается постоянной. Затем результаты можно отобразить на графике и проанализировать с помощью различных методов аппроксимации кривой.

Взаимодействия между белками и лигандами также изучаются с использованием различных биохимических и спектроскопических методов. Структурный анализ с использованием рентгеновской кристаллографии и ЯМР-спектроскопии помогает прогнозировать взаимодействия белок-лиганд посредством молекулярного моделирования. Теоретические и вычислительные подходы, такие как исследования докинга белков и лигандов, широко используются для характеристики положения и взаимодействия лигандов малых молекул, включая кандидаты в лекарственные препараты. Компьютерный дизайн лекарств — это быстрая и недорогая альтернатива ускорению традиционных испытаний лекарств методом проб и ошибок.