32.8: Принципы колоночной хроматографии

Метод хроматографии был впервые изобретен в 1901 году Михаилом Семёновичем Цветом, русским ботаником, для разделения растительных пигментов с использованием органических растворителей. Кроме того, в 1941 году Арчер Джон Портер Мартин и Р.Л.М. Синг модифицировали метод, плотно упаковав колонку силикагелем. Затем смесь аминокислот разделяли на упакованной колонке, используя смесь хлороформа и воды в качестве подвижной фазы. Это был первый отчет по колоночной хроматографии. В настоящее время колоночная хроматография является широко используемым методом разделения различных типов соединений из смеси проб.

Факторы, влияющие на эффективное разделение белков

Различные параметры, такие как материал колонки, упаковка и рабочие условия, такие как скорость потока и температура, определяют эффективность разделения с помощью колоночной хроматографии.

Выбор материала колонки или матрицы определяет степень взаимодействия с образцом. Матричный материал должен быть плотно и равномерно упакован в колонке. Пузырьки воздуха, мусор, крупные частицы и осадки мешают равномерному потоку растворителя через колонку, влияя на эффективность его разделения. Колонка также не должна содержать твердых частиц.

Образец, вводимый в колонку, должен быть прозрачным и не содержать агрегатов, которые могут засорить колонку и затруднить поток растворителя. Скорость потока растворителя также влияет на разделение. Очень высокие или очень низкие скорости потока растворителей приводят к неэффективному разделению соединений и нечистых препаратов. Очень высокие скорости могут также нарушить насадку колонки, что повлияет на эффективность процесса. Кроме того, важным фактором является состав элюирующего буфера. Он должен быть неагрессивным и совместимым с образцом, а также с материалом колонки, чтобы предотвратить осаждение или растворение на месте.

Важную роль в процессе играет и другой эксплуатационный параметр – температура. Он определяет стабильность образца, материала колонки и буферного растворителя. Кроме того, постоянная температура по всей колонке эффективно растворяет соединения. После завершения процесса разделения колонки необходимо тщательно промыть, многократно пропуская подходящий растворитель, чтобы избежать загрязнения пробы при дальнейших анализах. Иногда растворитель пропускают через колонку в обратном направлении, чтобы удалить застрявший материал.

Ограничения

Несмотря на то, что метод очень широко используется, он все же имеет некоторые ограничения. Это очень трудоемкий метод, поскольку для лучшего разделения соединений скорость потока должна быть меньше. Кроме того, большие количества растворителей высокой чистоты, необходимые в мобильной фазе, делают процесс дорогостоящим. Это также увеличивает затраты на расширение масштабов производства, когда необходимы более высокие выходы чистых соединений.

Колоночная хроматография — это биохимический метод, используемый для разделения соединений на основе их физических и химических свойств.

Он состоит из двух основных компонентов — твердой неподвижной фазы или матрицы и жидкой подвижной фазы или растворителя.

В матричную колонку загружается образец, например, белковая смесь. Затем растворитель используется для переноса образца через колонну.

Внутри колонки матрица действует как молекулярная сетка, фильтрующая белки в зависимости от их размера или взаимодействия с матрицей. Более крупные белки, как правило, перемещаются быстрее, чем более мелкие, что приводит к разделению по размеру.

Кроме того, белки в образце могут взаимодействовать с матрицей. Слабые взаимодействия позволяют белкам быстро проходить, в то время как сильные взаимодействия удерживают белки внутри колонки.

Постепенное изменение pH или ионной силы растворителя изменяет взаимодействие белков с матрицей и помогает элюировать белки в отдельные фракции.