32.13: Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг — это аналитический метод идентификации белков. Он имеет различные применения в иммунологии и медицине, в том числе для обнаружения таких заболеваний, как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота, коровье бешенство и вирус иммунодефицита человека и кошек из биологических образцов.

Метод начинается с отделения белков от образца с помощью электрофореза в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE), за которым следует перенос белка, иммуноблоттинг и, наконец, обнаружение белка.

Белки из полиакриламидного геля переносятся на специализированные мембраны, такие как нитроцеллюлоза (NC) или поливинилидендифторид (PVDF). По сравнению с ЧПУ, PVDF обладает более высокой прочностью и способностью связывать белки и может быть повторно исследован.

Перенос белка осуществляется либо с помощью электрического тока (электроблоттинг), либо с помощью капилляров. При электроблоттинге гидрофобные взаимодействия переносят отрицательно заряженные белки из геля и захватывают их на мембране. В другом методе фильтровальная бумага, помещенная на гель, пропитывает буфер капиллярным действием, одновременно вытягивая белки из геля и перенося их на мембрану. Чтобы обеспечить качество переносимых полос, неспецифические белковые красители, такие как Ponceau S, позволяют провести обратимую проверку.

Следующий этап, иммуноблоттинг, включает в себя обработку мембраны блокирующим буфером, таким как 3-5% бычий сывороточный альбумин или обезжиренное сухое молоко. Эти буферы снижают вероятность неспецифического связывания первичного антитела с мембраной. Первичные антитела могут быть поликлональными или моноклональными и связываться с белковыми полосами на мембране через их Fab-область. Далее добавленные вторичные антитела связываются и прикрепляются к Fc-области первичных антител. Вторичные антитела помечаются ферментами, которые при добавлении подходящего субстрата продуцируют обнаруживаемые колориметрические или хемилюминесцентные сигналы. Кроме того, методы денситометрии могут количественно оценить оптическую плотность этих визуализируемых полос, соответствующую обилию белков в образце.

На ожидаемый результат вестерн-блоттинга могут влиять различные факторы, такие как ошибочная загрузка образца, неточный перенос с захваченными пузырьками воздуха и использование неспецифических антител. Кроме того, неподходящие концентрации первичных и вторичных антител и загрязненные буферы могут повлиять на качество полос и их визуализацию.