Традиционно вертикальная часть и целое монтажа подготовки сетчатки были использованы для изучения функции сетчатки схем. Здесь мы описываем новый метод нарезки сохранить дендритных морфологии нейронов сетчатки без изменений.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Горизонтальное Подготовка Кусочек сетчатки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Традиционно вертикальная часть и целое монтажа подготовки сетчатки были использованы для изучения функции сетчатки схем. Однако многие из нейронов сетчатки, такими как amacrine клеток, расширить свои дендриты горизонтально так, что морфология клетки должна быть серьезно поврежден в вертикальных срезов. В целом монтажа подготовки, особенно для патч-зажим записей, нейронов сетчатки в среднем слое не являются легкодоступными из-за широкого освещения глиальные клетки (Мюллер ячейки) endfeets с. Здесь мы описываем новый метод нарезки сохранить дендритных морфологии нейронов сетчатки без изменений. Срез был сделан горизонтально на внутренний слой сетчатки использованием vibratome слайсер после сетчатки было заложено в низкой температурой плавления агарозном геле. В этом горизонтальные подготовки кусочек сетчатки, мы изучили функцию нейронов сетчатки по сравнению с их морфологии, с помощью патч-зажим записи, техника визуализации кальция, иммуноцитохимия, и одноклеточные RT-PCR.
Протокол
- Подготовка агара блок (30 мг / мл, то есть 3%, в дистиллированной воде). Растворите и микроволновые это первый и перелить его в стеклянную посуду. Держите блюдо в холодильнике при температуре 4 ° С.
Совет: агар блок должен быть подготовлен заранее.
- Подготовка низкой температуры плавления агарозном геле (25 мг / мл, т.е. 2,5%, в среде). Растворите и микроволновые его. Храните ее в ванну с горячей водой при температуре 35 ° С.
Совет: Имейте в агарозном геле не слишком жарко. Если она слишком горячая, она занимает много времени, чтобы быть затвердевшим, и гель может убить сетчатки
. - Усып....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть несколько важных преимуществ горизонтальной подготовки кусочек сетчатки.
Во-первых, морфология клетки, которые расширяют дендритов горизонтально, таких как amacrine клетки и горизонтальные клетки, сохраняется. Было показано, что Есть более 20 видов amacrine клеток в сетчатке (Макнил и Masland, 1998), так что это довольно важно сравнить морфологию клеток с физиологического свойства.
Во-вторых, в целом монтажа сетчатки, широкое освещение endfeets глиальных клеток с предотвращает доступ патч для пипеток amacrine клеток. В .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все экспериментальные протоколы были проведены в соответствии с Национальными Институтами Здоровья руководящие принципы для использования животных.
Благодарности
Мы благодарим доктора. Ричард Х. Masland и Акимичи Канеко за предоставленную нам ценные советы и предложения устанавливает порядок горизонтальных подготовки кусочек сетчатки.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Агар | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Агароза L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Низкоплавкий агароз |
| Гиалуронидаза | Sigma-Aldrich | Тип I-S, 300 Ед/мг | |
| Среда | в мМ: 102 NaCl, 3,1 KCl, 2,0 CaCl2, 1,0 MgCl₂2, 23 NaHCO33и 10 глюкозы при pH 7,8, или Ames’ Раствор (Sigma) | ||
| Микроволновая печь | |||
| Водяная баня | 35 °C | ||
| Вибратом, вибротомический микротом | Leica Microsystems | VT1000S | |
| МФ-мембранные фильтры | EMD Millipore | HAWP01300 | Фильтровальная бумага, размер пор 0,45 мкм µм |
| Инструменты для диссекции | пинцет, лезвие, зажим, пинцет <электронная микроскопия>и т. д.. | ||
| Мгновенный клей | <электронная микроскопия>например, Alonalpha, Krazy Glu | ||
| Шприц объемом 50 мл | |||
| Шприцевой фильтр | EMD Millipore | SX0001300 |
Ссылки
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
