Дрозофилы личинок NMJ Dissection

Краткое содержание

Этот протокол свидетельствует о том, как рассекают Drosophila Личинок в подготовке к иммуногистохимии и / или изображений нервно-мышечном соединении.

Протокол

Перед тем как начать

1. Все культуры следует выращивать при температуре 25 ° C.
2. HL3.1 рассечение буфер может быть подготовлен заранее. Возьмите 50 мл аликвоту HL3.1 и держать его на льду.
3. Подготовка 15 мл свежего 3,5% формальдегида в HL3.1. Держите его на лед.

Личинки Dissection

1. Поместите каплю холодной HL3.1 на вскрытии пластины. Это будет держать животных от высыхания и оглушить животное делает его легче работать.
2. Использование длинный пинцет, выберите блуждающих третьей взрослой личинки и поместить его в каплю HL3.1.
3. Во-первых, использовать короткие щипцы понять контактный minutien. Место контактный между задних дыхальца. Животных, как правило, пытается отползти от контактный растяжения себя, и делает его более легким для вас место контактный прямо в голову личинки в районе устья крючков. Стретч животное из продольно. Это поможет вам максимизировать количество выставленных стенки тела можно достичь в процессе резки. Примечание: Если вы решили контактный головой вперед, животное может обернуть его вокруг тела булавкой или кнут своего тела вперед и назад, что делает его трудно точно определить. Обычно вы можете противостоять этому, удалив HL3.1 и положить свежие холодная капля потрясающих животных снова. Симметричная ученый также можете просто схватить животное и удерживать его на месте.
4. Использование ножниц весной сделать горизонтальный надрез только впереди задний штифт на спинной стороне личинки. Разместите один лезвие ножниц в разрез и сделать вертикальный разрез по средней линии спины к ростральной конце личинки. На трибуну животных делают горизонтальные разрезы, чтобы слева и справа от булавки. Примечание: конечный результат должен выглядеть так я на спинной стороне личинки вместе rostrocaudal оси.
5. Удалить органов. Начните, положив несколько дополнительных капель HL3.1 на личинку. Это позволит органам всплывают из организма позволяет удалить их гораздо легче. Во-первых, удалите трахеи системы. Во-вторых, использование щипцов, чтобы захватить остальные органы и удалить их.
6. В шаге 3 вы сделали левый и правый клапан клапан в стенке тела. Pin закрылки по часовой стрелке и обязательно растягивать стенки тела по горизонтали и по вертикали.

Фиксация

Fix каждого животного в 3,5% формальдегида в HL3.1 течение 25 минут. Мыть животное дважды в HL3.1 течение 5 минут.

Хранение

Удалите булавки и передачи личинок 1,5 мл пробирку 1X PBS. Если вы планируете изображение NMJ использовании плавленого флуоресцентные метки, Вы должны изображение животных в течение двух дней. Вы можете хранить расчлененный личинок на срок до одной недели при температуре 4 ° C.

Представитель результаты

Есть несколько ключевых компонентов правильно расчлененные личинки дрозофилы. Во-первых, нужно проявлять особую осторожность, чтобы не повредить мышцы, особенно мышцы 4, 6 и 7. Это самый популярный мышцы учиться и, если они повреждены отказаться филе приготовительные и анализировать другим животным. Во-вторых, надо убедиться, что животное максимально растягивается так, что каждая мышца и NMJ можно выделить.

Обсуждение

Рассечение технику продемонстрировал в этом видео можно использовать для подготовки дрозофилы личинок для различных экспериментальных методик. Если флуоресцентные метки белка присутствуют, личинки могут быть смонтированы и отображаемого сразу. В противном случае, иммунной могут быть выполнены для того, чтобы помечать определенные синаптические отсеков. Кроме того, электрофизиологии могут быть легко выполнены на расчлененный личинки оценить функционирование нервных импульсов.

NMJ

Материалы