Дрозофилы личинок NMJ Dissection

Краткое содержание

Этот протокол свидетельствует о том, как рассекают Drosophila Личинок в подготовке к иммуногистохимии и / или изображений нервно-мышечном соединении.

Протокол

Перед тем как начать

1. Все культуры следует выращивать при температуре 25 ° C.
2. HL3.1 рассечение буфер может быть подготовлен заранее. Возьмите 50 мл аликвоту HL3.1 и держать его на льду.
3. Подготовка 15 мл свежего 3,5% формальдегида в HL3.1. Держите его на лед.

Личинки Dissection

1. Поместите каплю холодной HL3.1 на вскрытии пластины. Это будет держать животных от высыхания и оглушить животное делает его легче работать.
2. Использование длинный пинцет, выберите блуждающих третьей взрослой личинки и поместить его в каплю HL3.1.
3. Во-первых, использовать короткие щипцы понять контактный minutien. Место контактный между задних дыхальца. Животных, как правило, пытается отползти от контактный растяжения себя, и делает его более легким для вас место контактный прямо в голову личинки в районе устья крючков. Стретч животное из продольно. Это поможет вам максимизировать количество выставленных стенки тела можно достичь в процессе резки. Примечание: Если вы решили контактный головой вперед, животное может обернуть его вокруг тела булавкой или кнут своего тела вперед и назад, что делает его трудно точно определить. Обычно вы можете противостоять этому, удалив HL3.1 и положить свежие холодная капля потрясающих животных снова. Симметричная ученый также можете просто схватить животное и удерживать его на месте.
4. Использование ножниц весной сделать горизонтальный надрез только впереди задний штифт на спинной стороне личинки. Разместите один лезвие ножниц в разрез и сделать вертикальный разрез по средней линии спины к ростральной конце личинки. На трибуну животных делают горизонтальные разрезы, чтобы слева и справа от булавки. Примечание: конечный результат должен выглядеть так я на спинной стороне личинки вместе rostrocaudal оси.
5. Удалить органов. Начните, положив несколько дополнительных капель HL3.1 на личинку. Это позволит органам всплывают из организма позволяет удалить их гораздо легче. Во-первых, удалите трахеи системы. Во-вторых, использование щипцов, чтобы захватить остальные органы и удалить их.
6. В шаге 3 вы сделали левый и правый клапан клапан в стенке тела. Pin закрылки по часовой стрелке и обязательно растягивать стенки тела по горизонтали и по вертикали.

Фиксация

Fix каждого животного в 3,5% формальдегида в HL3.1 течение 25 минут. Мыть животное дважды в HL3.1 течение 5 минут.

Хранение

Удалите булавки и передачи личинок 1,5 мл пробирку 1X PBS. Если вы планируете изображение NMJ использовании плавленого флуоресцентные метки, Вы должны изображение животных в течение двух дней. Вы можете хранить расчлененный личинок на срок до одной недели при температуре 4 ° C.

Представитель результаты

Есть несколько ключевых компонентов правильно расчлененные личинки дрозофилы. Во-первых, нужно проявлять особую осторожность, чтобы не повредить мышцы, особенно мышцы 4, 6 и 7. Это самый популярный мышцы учиться и, если они повреждены отказаться филе приготовительные и анализировать другим животным. Во-вторых, надо убедиться, что животное максимально растягивается так, что каждая мышца и NMJ можно выделить.

Обсуждение

Рассечение технику продемонстрировал в этом видео можно использовать для подготовки дрозофилы личинок для различных экспериментальных методик. Если флуоресцентные метки белка присутствуют, личинки могут быть смонтированы и отображаемого сразу. В противном случае, иммунной могут быть выполнены для того, чтобы помечать определенные синаптические отсеков. Кроме того, электрофизиологии могут быть легко выполнены на расчлененный личинки оценить функционирование нервных импульсов.

NMJ

Материалы

HL3 Dissection буфера: (в мм) 70 NaCl, 5 KCl, 0,2 CaCl2, MgCl2 20, 10 NaHCO3, 5 трегалозу, 115 сахарозы и 5 HEPES, рН 7,3.
Sylgard Пройдя плиты: Тщательно перемешать (чтобы избежать пузырей) 10:1 в стакан. Вылейте смесь в чашку Петри (любого размера). Разрешить SylGard вылечить ночь в 37C инкубатора.