В этой статье описываются высоким временным и пространственным разрешением технику оптически образ потенциала действия движения на поверхности Langendorff-перфузии сердца крысы использованием потенциометрического красителя (ди-8-ANEPPS).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оптический Картирование Langendorff-перфузии сердца крысы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Оптическое картирование поверхности сердца с использованием вольт-чувствительных флуоресцентных красителей стало важным инструментом для исследования электрического возбуждения в экспериментальных моделях разного масштаба: от клеточных культур до целых органов[1, 2]С помощью современных систем оптической визуализации можно практически мгновенно наблюдать за генерацией и распространением потенциалов действия при нормальном сердечном ритме, а также в процессе возникновения и поддержания аритмий[1]Современные коммерчески доступные системы позволяют получать данные с чрезвычайно высоким пространственно-временным разрешением; они были созданы на базе специализированного оборудования, разработанного изначально для преодоления ограничений, присущих более традиционным электрофизиологическим методам[1]Достижения в области создания высокоразрешающих и высокоскоростных камер на базе комплементарных металло-оксид-полупроводниковых структур (КМОП/CMOS) и сверхъярких светоизлучающих диодов (СИД/LED), а также развитие вольт-чувствительных красителей, оптики и фильтров сделали регистрацию электрических сигналов доступной для биологов сердечно-сосудистых клеток, более привыкших к работе с микроскопами. Хотя камеры КМОП последнего поколения способны регистрировать 10 000 кадров в секунду при размере матрицы 16 384 пикселя, давно зарекомендовавшие себя технологии регистрации флуоресценции, такие как фотодиодные матрицы, системы лазерного сканирования и охлаждаемые камеры на приборах с зарядово-связанными устройствами (ПЗС/CCD), все еще обладают определенными преимуществами с точки зрения динамического диапазона, соотношения сигнал/шум и квантовой эффективности в зависимости от типа подготовки образца.[1, 3]В настоящем исследовании проводили перфузию сердец крыс линии Lewisex vivoс использованием кристаллоидного перфузата (раствор Кребса-Хензелейта) при 37°C на модифицированном аппарате Лангендорфа. После 20-минутного периода стабилизации сердца подвергали периодической перфузии 11 mMol/L 2,3-бутандионмоноксимом для устранения сократительных движений во время получения изображений. Для проведения оптического картирования сердца нагружали потенциометрическим зондом с быстрым откликом di-8-ANEPPS[4](5 μMol/L) и кратковременно освещали препарат возбуждающим светом с длиной волны 475±15 nm. В течение типичного 2-секундного периода освещения свет с длиной волны >605 nm, излучаемый препаратом сердца, регистрировался с помощью высокоскоростной CMOS-камеры, подключенной к горизонтальному макроскопу. Для данной демонстрации ритм сердец поддерживался на уровне 300 ударов в минуту с использованием коаксиального электрода, подключенного к изолированному блоку электрической стимуляции. Одновременно с сигналами напряжения регистрировались и анализировались биполярные электрографические записи с помощью доступного программного обеспечения. Таким образом, потенциалы действия на поверхности перфузируемых по Лангендорфу сердец крыс могут быть визуализированы и сопоставлены с электрографическими сигналами.
Протокол
Часть 1: Подготовка решений и изолированной перфузии система сердца
- В первой половине дня эксперимента, 4,0 л Кребса Хенселейта готовят, как описано ранее [5, 6].
- 11 ммоль / л 2,3-бутандион monoxime (BDM) растворяют в 1,0 л Кребса Хенселейта сливают из перфузат подготовлен в шаге 1.1.
- Дополнительные 150 мл Кребса Henseleit удаляется из перфузат подготовлен в шаге 1.1 и смешивают с 5 моль / л ди-8-ANEPPS (разбавленный от 10 ммоль / л растворенного в акции диметилсульфоксид (ДМСО)).
- Эти три решения передаются на водяной рубашкой стекла водохранилищ (Radnoti), где они предварительно нагревают до 41,0 ° С и кислородом с погруженной барботер (Radnoti) с использованием 0,2 мкм фильтром 95% O 2, 5% СО 2. Решения от 3 резервуара запаса перекачивается настенные системы Langendorff с Masterflex ™ L / S перистальтических насосов и низким поглощением силиконовые трубки (Cole-Parmer).
- Перед сборкой, Langendorff системы стеклянная посуда (Radnoti) тщательно промывают E-TOXA-CLEAN реагента (Sigma-Aldrich) и тщательно промыть 0,1 М / л HCl, 100% этанола и дистиллированной воды.
- Без рециркуляции Langendorff аппарат был построен по доставке 70 мм рт постоянного давления от 3 отдельных кислородом водоемах, которые отделены от сердца с водяной рубашкой нагрева катушки и пузырь ловушек (Radnoti) [7]. 3 независимых линий перфузии сходятся выше сердца на двух 3-полосная кранами, что позволяет нам точно контролировать доставку растворов, приготовленных с шагом 1,1 до 1,3. С водяной рубашкой посуды подключается последовательно с Masterflex Pharmed трубки BPT (Cole-Parmer) и нагревают до 39 ° С дистиллированной воды с помощью двух E100 циркуляторы (Лауда). Потери тепла через платиновые сушки силиконовые трубки (Cole-Parmer), который подключается к давлению головы резервуары для нагрева катушки и пузырь ловушки привели к 37 ° C перфузат достижения сердце.
Часть 2: Harvest сердца крысы и настройки перфузии Langendorff
- Для стимулирования глубокой общей анестезии в 200-250 г Льюис крыс 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг Ксилазин вводят внутрибрюшинно полости. К этой смеси добавить 500 ЕД / кг гепарина для предотвращения свертывания крови и ишемии миокарда во время эксплантации процедуры.
- Для легкого доступа к сердца и магистральных сосудов, передней стенки грудной клетки удаляется. После этого, окружающие ткани, тщательно расчленены и перикарда мешок открыт.
- После идентификации нижнюю полую вену, этот сосуд лигируют с 5-0 шелк (Ethicon) и все сердце-легкие блок эксплантированных. Ткань сразу помещают в ледяной Кребса Хенселейта, содержащихся в 50 мл стакан на льду.
- Восходящей аорты быстро выявлены и расчлененных от окружающих тканей. Соответствующего размера канюли (Harvard аппарата) вводится в аорту, заботясь, чтобы не прерывать обязательным перфузии коронарных артериях путем введения канюли слишком далеко в корне аорты. Канюля прикреплена к восходящей аорты с 5-0 шелк (Ethicon).
- Сердце крысы затем помещается в аппарат Langendorff без введения пузырьков воздуха в канюлю. Ретроградная перфузия коронарных сосудов в настоящее время установлено с теплой, насыщенной кислородом Кребса Хенселейта от давления головы, описанных в пункте 1.6.
- Дополнительные ткани, включая легкие, теперь удалены и сердце перфузии в течение 20 минут разрешить восстановление функции и стабилизировать ритм. В это время, очень тонкий термопарой температуру (Коул-Пармер) вводится в полость левого желудочка и зашивается в месте с 5-0 Prolene шва (Ethicon). Зонд соединен с термо-контроллер (Digi-Sense), чтобы обеспечить температуру сердца поддерживается на уровне 37 ° С, регулируя настройки водяных насосов кровообращения. Движение от перфузат капает с сердечной вершине сведена к минимуму путем размещения кусок марли в сточных водах сосуд.
Часть 3: Загрузка сердце потенциометрического красителя и приобрести электрографии и оптических сигналов
- Ди-8-ANEPPS (Invitrogen) загружается в сердце за счет перехода на перфузию строку, содержащую Кребса Henseleit смешанного с использованием флуоресцентного красителя краном. Кроме того, канюли 18G помещается в левый и / или правого предсердия и дополнительные 50 мл раствора красителя медленно вводят в каждой из этих камер, потому что они не являются достаточно озарен краситель вводится через коронарные артерии.
- Во время процедуры загрузки, 3 отведений ЭКГ (Harvard аппарата) мягко размещены на поверхности сердца, что не грозит оптика используется для отображения. Электрод N O 1 расположен на задней апикальной части левого желудочка, N 2 O на левое предсердие, а N р> о 3 в качестве электрода сравнения от корня аорты (рис. 1). Предсердий и желудочков электрографических сигналы впоследствии усиливается, оцифровывается и отображается рядом с оптических сигналов с использованием программного обеспечения (RedShirt изображения) (рис. 2). Осциллограф (Tektronix TDS модель 1002) также используется для визуализации поверхности ЭКГ с в режиме реального времени и для обеспечения адекватной стимуляции.
- ЭКГ усилитель (Hugo Sachs Elektronik) настройки: Фильтр высоких частот: 0,1 Гц
Фильтр низких частот: 150 Гц - CMOS-камера (RedShirt Imaging) и macroscope позиционируется использованием XYZ корректировки так, чтобы поверхность сердца находится в фокусе и по центру в приобретении кадра. Камеры и оптики смонтированы на стол виброизоляции (минус К Technology) для минимизации резонансных частотах. В то же время, коаксиальных электродов стимуляции (Harvard аппарата), контролируемых с изолированной, S48 электрической стимуляции единицы (трава), находится на правом предсердии и сердце темп в 300 ударов в минуту (рис. 1).
- Электростимуляция (трава) параметры:
Оценить: 5 импульсов в секунду
Задержка: 0,2 мс
Продолжительность: 2 мс
Вольт: 6-12 V
Режим: Повторите
Пульс: Одноместный - Для оптической записи которых отсутствуют артефакты от сжатия, сердце должно быть электромеханическим отцепили. Мы делаем это снова переключения перфузии линии Кребса Хенселейта, который содержит 11 ммоль / л BDM. Между поглощений, сердце озарен чистейший Кребса Henseleit, чтобы помочь сохранить жизнеспособность подготовки.
- Запись параметры задаются с помощью программного обеспечения (RedShirt Imaging) со следующими параметрами приобретения:
Конфигурация: 2000 Гц; 128x128 пикселей массив
Frame Interval: 0,5 мс
Камера усиления усилителя: 5x
On-Chip Усиление: 8x-12Me-а
Затвор: 500 мс задержки
Количество кадров: 4000
Продолжительность: 2000 мс - Все комнаты и оборудование свет выключен или экранированный для устранения фоновых шумов во время записи. Светодиод горит сердце только во время оптической записи, чтобы уменьшить фото-отбеливание и красителя токсичности. Свет затвора источник управляется с 5 V импульса доставлен через панель управления в виде D-до-плату в компьютер (RedShirt Imaging).
Часть 4: Анализ приобретения информации с использованием программного обеспечения RedShirt изображений
- После приобретения, данные обрабатываются с использованием различных параметров фильтра. Мы обычно используем настройки по умолчанию, за исключением при регулировке Группа Стоп / Pass фильтр, который устанавливается с левой границы на 44,0 и правой границы на 98,0. Потом записали информация обрабатывается и кино порождается (RedShirt Imaging).
- Данные из одной приобретение соответствует местной электрической активации на 16 384 сайтах в сердце поверхности в течение 2 секунд. Программное обеспечение позволяет эти локальные сигналы, которые будут непосредственно сравнивать друг с другом и с предсердий и желудочков электрографических записей. Затем данные визуализируются путем сопоставления местной электрической активации по цвету и оказание эту информацию, как анимация показывает пространственно-временной электрической активации на сердечную поверхности. Для создания такой анимации, мы используем программное обеспечение:
- во времени и / или пространственно фильтрации данных
- выберите время начала и окончания для анимации
- Карта оптических сигналов на цвет, основываясь на покоящихся интенсивность света каждого пикселя
- Наложение полученные данные цвета с изображением сердца
- генерировать анимацию
Часть 5: Представитель результаты
Если перфузии подготовке сердце было неподвижно во время записи, оптические сигналы показывают один четкий пик для каждого пикселя, участвующих в изменении интенсивности излучения ди-8-ANEPPS. Соответствующие фильмы (рис. 3 и 4) продемонстрировать перед возбуждения волны, распространяющейся по всей поверхности эпикарда сердца, а также одновременно приобрел электрографических записи (рис. 2).
Рисунок 1. Фотографию Langendorff-перфузии сердца подготовки изображением позиций ходить электрода на правое предсердие и отведений ЭКГ, как описано в пункте 3.2.
Рисунок 2. Представителю оптических сигналов и электрографии записи с перфузии сердца крысы Льюис. Группа показывает изображение поверхности эпикарда используемых для оптических изображений. Положение пикселей выбран для демонстрации изменения в флуоресценцию излучения с течением времени в панели B обозначены цветными стрелами. Электрографические сигналы отображаются в панели C с красной линией, указывающей предсердной активации и голубые линии, соответствующей желудочка сигнала. Пожалуйстаve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Удаление сердца от анестезии крыс должна быть выполнена быстро, чтобы избежать ишемии миокарда. Если ишемия или недостаточное коронарной перфузии происходит, сердце, скорее всего, развиваться аритмий и может стать инфаркта. Кроме того, эти сердца покажет недостаточной флуоресценции выбросов информативные записи и последующего анализа. Перед загрузкой краситель, клетки миокарда должны быть надлежащим образом озарен Кребса Хенселейта для установления и поддержания физиологической среде электролита для стабильности электри...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитетом на Детской больнице Бостона.
Благодарности
Эта работа проводится при поддержке грантов от Национального института здоровья (HL068915; HL088206) и взносов в Фонд сердечной проводимости при Детской больнице Бостона.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| CardioCMOS-SM128f | Оборудование | RedShirtImaging, LLC | ||
| Программное обеспечение CardioPlex | Оборудование | RedShirtImaging, LLC | ||
| Светодиодный источник света LUXEON 460-490 nm | Оборудование | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| Усилитель ЭКГ тип 689 Hugo Sachs Elektronik | Оборудование | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Дихроичное зеркало 505 nm | Оборудование | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Эмиссионный фильтр длинноволновой пропускающий 605 nm | Оборудование | SciMedia | ||
| THT Sideways | Оборудование | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Держатель с миниатюрным шарниром | Оборудование | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Комплект малых стимулирующих электродов | Оборудование | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| Настольная виброизоляционная платформа BM-6 | Оборудование | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Монополярный электрод ЭКГ | Оборудование | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Роликовый насос SCI 400 | Оборудование | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Роликовый насос MasterFlex Easy Load II | Оборудование | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Трубки Marprene №14 | Оборудование | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| Трубки MasterFlex | Оборудование | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| Стимулятор прямоугольных импульсов S48 | Оборудование | Grass Technologies | Model S48 | |
| Блок РЧ-трансформаторной развязки SIU5 | Оборудование | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| Резервуар с водяной рубашкой объемом 5 л | Оборудование | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| Резервуар с водяной рубашкой объемом 2 л | Оборудование | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| Резервуар с водяной рубашкой объемом 0,5 л | Оборудование | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| Резервуар с водяной рубашкой объемом 0,25 л | Оборудование | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| Нагревательный змеевик 10 ml | Оборудование | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Компенсационный ловушка для пузырьков | Оборудование | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Канюля с разъемом Luer | Оборудование | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| Трехходовой кран, FLL в MLT, без крышек портов | Оборудование | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Термопара-термометр | Оборудование | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Сверхтонкий гибкий микрозонд серии IT | Оборудование | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Осциллограф Tektronix TDS 1002 | Оборудование | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-бутандионмоноксим | Реагент | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Кетамина гидрохлорид | Реагент | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Ксилазин | Реагент | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Реагент | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Реагент | Invitrogen | D-3167 |
Ссылки
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
