Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Препарирование Saccharomyces CEREVISIAE Сумки

18.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/1146

⸱

19 мая 2009 г.

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University

В этой статье

Краткое содержание

Микроманипуляция дрожжевых клеток необходимо для мейоза генетического анализа или для выбора диплоидные зиготы. Эти micromanipulations осуществляются с помощью микроиглы о вскрытии микроскопом. Микроиглы используется для перемещения клетки и находится под контролем микроманипулятора, которые доступны с различной степенью автоматизации.

Аннотация

Дрожжи очень послушный модель системы, которая используется для изучения различных клеточных процессов. Общая нагрузка лаборатории

Протокол

Строительство диплоидных штаммов
Протокол для производства диплоиды в результате скрещивания

  1. Начальная штаммы должны быть исключены на YPD или селективной среде, в случае необходимости, для получения отдельных колоний. Два гаплоидных штаммов должны быть противоположного типа спаривания (т.е. Мата и MATα).
  2. Использование стерильной петлей прививки выбрать небольшую часть колонии с одного из двух гаплоидных штаммов. На новом YPD полоса пластины цикла раз в прямой линией, пересекающей пластине. Марк направление штрих, с стрелку на нижней пластине.
  3. Повторите эту процедуру для второго нагрузку на YPD же пластины. На этот раз полоса колонии перпендикулярно к первой, пересекая первую полосу со второй. Марк направление второй полосе и обратите внимание на область, где вторая полоса пересекает первую очередь. Эта область будет где диплоиды будет производиться.
  4. Инкубируйте YPD пластины при температуре 30 ° С в течение ночи.
  5. Реплика пластины YPD пластины на селективных средах, что будет выборочно разрешать рост новообразованных диплоиды.
  6. Выберите одну колонию, если это возможно, или небольшая часть полосы диплоидных и полосы на тот же селективной среды для получения отдельных колоний.

Плодоношение и пищеварение асков
Протокол

  1. Выберите одну из колоний пластины выше и делать небольшие (1см х 1см) пятна на споруляции (SPO) пластин и инкубировать при 30 ° С в течение 3-7 дней, чтобы sporulate.
  2. Плодоношение можно проверить, посмотрев на клетки от каждого патча под световым микроскопом. Место клетки на предметном стекле микроскопа в 5-10 мкл воды, место покровное в верхней части капли, и посмотреть на наличие сумки. Если сумки не легко найти то положил обратно в инкубатор.
  3. Если есть эффективные споруляции в одном из патчей, готовят стерильные 15 мл коническую трубку с 100 мкл сок тетрады.
  4. Выберите клетки по сравнению с этим споруляции патч с стерильные 3 мм петля прививки (клетки должны охватывать четверть цикла) и место в соке тетрады. Аккуратно водоворот цикл, чтобы клетки падать петля и смешать с раствором.
  5. Оставить в тетрады сок (содержащий zymolyase) для 4-10 минут (в зависимости от концентрации и активности zymolyase и деформаций себя). Это позволяет для переваривания клеточной стенки окружающего аскоспор.
  6. Марк верхней и нижней части посевного области на YPD пластины.
  7. Необязательно. Реакция может быть остановлено путем добавления 1 мл ледяной стерильной дН 2 O. Разрешить клетки согласиться на 5 мин. Удалить из 1 мл надосадочной затем смешайте слегка рукой и держать на льду.
  8. Возьмите 5 мкл переваренной клетки с шага 5, нежно кладем капель в строке в посевной области заранее заполненных YPD пластины.
  9. Используйте стерильные 3 мм петля прививка очень мягко распространению капель 1-3 раза в линии, а едва контакт с агара.
  10. Дайте жидкости впитаться в агар (шаг 7 Если не указано, это когда переваривание внешней клеточной стенки будут сокращены или остановка). Приступить к рассечение микроскопом.

Препарирование Аски
Протокол

Обратите внимание, что следующий протокол описан для системы Певица MSM 200 микроманипуляция микроскопом. Этот протокол может следовать с небольшими изменениями, если используется ручной микроманипулятора, таких как микроманипулятора Zeiss MR.

  1. Сосредоточьтесь на области пластины, где половина поле содержит клетки и половину пуст. Медленно иглы в центр внимания, что она касается пустой области поля. Это гарантирует, что игла не содержат клетки от предыдущего использования. Контакт между иглой и агар рассматривается как темный черный круг, который медленно вступает в фокусе.
  2. К матрице на позиции А1 и сделать отметку, прокалывая агар снова. Это поможет определить ориентацию пластины, если она снимается микроскопом до завершения.
  3. Переключение в режим поиска. Найдите сумки. Предпочтительно выбирать сумки, которые находятся в районах, где клетки хорошо распространено. Избегайте мест с клеточными кластерами. Четыре аскоспор из сумки все равно должны быть привязаны друг к другу. Два аскоспор может быть немного больше, чем два других. Избегайте выбора сумки, где один аскоспор является свободным и не связан с остальными аскоспор.
  4. Возьмите сумке с иглой. Медленно иглы до пластины. Когда тени микроиглы видно, линии это с сумке, чтобы ее взяли. Снова подход иглы, пока черный контур круга (кончик иглы) не наблюдается. Сенсорный тетрады с этим кругом, а затем быстро вытащить иглу прочь. Убедитесь, что все четыре аскоспор от аск присоединившимся к игле и что никакие дополнительные ячейки были собраны на микроиглы, которые не являются частью этой сумке.
  5. Вытяните микроиглы далеко от плиты и перейти к матрице (для первого сумке, перейдите кпозиция А1). Обратите внимание на каждую позицию, где аск перемещается. Место аск вниз, касаясь пластины с микроиглы и трогания с места, пока все четыре аскоспор оторваться микроиглы. Нежный прослушивание руки иглу или платформы холдинга YPD пластины часто бывает полезно на этом шаге.
  6. Повторите шаги 3-5 и место сумки вниз на последовательных позиций на матрице до желаемого количества сумки были собраны.
  7. Вернитесь к каждой сумке и сломать четыре клетки на части дразня с иглой, постукивая платформы мягко или комбинация обоих. Возьмите клетки, оставляя одну позади на новую позицию в матрице, пока каждый аскоспор В каждой сумке разделен на строки из четырех человек.
  8. Место YPD пластины в инкубаторе при температуре 30 ° С в течение нескольких дней наблюдать модель роста.
  9. Реплика пластины расчлененные клеткам селективные среды, если это необходимо.

Перемещение Зиготы
Протокол

  1. Подряд два гаплоидных штаммов с противоположных типов спаривания на соответствующую среду для получения отдельных колоний.
  2. Мать этих двух штаммов, как описано выше, и позволяют выращивать в возрасте от 4 до 6 часов (или на ночь, если это необходимо).
  3. Проверьте зиготы под световым микроскопом. Зиготы появится как гантели клетки с помощью или без почки.
  4. Выберите клетки с 3 мм петля прививки (клетки должны охватывать четверть цикла) и место мягко 100 мкл стерильной дН 2 O.
  5. Марк верхней и нижней части посевного области на YPD пластины.
  6. Возьмите 5 мкл, нежно кладем капель в строке в посевной области заранее заполненных YPD пластины.
  7. Используйте 3 мм петля прививки распространяться капель в линию очень мягко в то время как едва контакт с агара.
  8. Дайте жидкости впитаться в агар. Приступить к рассечение микроскопом.
  9. Сосредоточьтесь на области пластины, где половина поле содержит клетки и половину пуст. Медленно иглы в центр внимания, что она касается пустой области поля. Это гарантирует, что игла не содержат клетки от предыдущего использования. Контакт между иглой и агар рассматривается как темный черный круг, который медленно вступает в фокусе.
  10. К матрице на позиции А1 и сделать отметку, прокалывая агар снова. Это поможет определить ориентацию пластины, если она снимается микроскопом до завершения.
  11. Переключение в режим поиска. Найдите зиготы.
  12. Возьмите зиготы с иглой.
  13. Место зиготы индивидуально на матрицу.
  14. Разрешить зиготы расти в течение нескольких дней.
  15. Реплика пластины зиготы на соответствующей селективной среде.

Представитель Результаты

figure-protocol-1
Рисунок 1: спаривание двух гаплоидных штаммов противоположных типов спаривания генерирует диплоидного штамма.

figure-protocol-2
Рисунок 2: () YPD пластины с Автошоу результаты спаривания между температурой чувствительного штамма (с leu2 auxotrophy) и дикого типа (LEU2). Дайджестом клетки распространяются в регионе посевной слева, где толстые роста между двумя черными линиями видел. Сумки, которые были расчлененные расти равномерно распределенных в матрице справа. (B) пластина в (А) была воспроизведена на SD-лейцин, бросающих пластины. Обратите внимание, 2:02 роста LEU2 маркер, указывающий проверки аскоспор был расчленены. (C) пластина в (А) была воспроизведена на YPD пластины и инкубировали при 37 ° C. Обратите внимание, 2:02, что дальнейший рост подтверждает, что аскоспор были расчленены.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Дрожжи вскрытия является полезным инструментом для выбора новых штаммов с нужными маркерами. При определении теоретической модели роста из четырех аскоспор важно, чтобы смотреть на генотип вегетативные клетки. Если плазмиды присутствует, надо знать, если она не замужем, низкая или высокая копию как это повлияет на котором аскоспор (ы) получают плазмиды и повлияет на прогнозы и выводы в отношении штаммов манипулируют.

Некоторые штаммы могут sporulate лучше, чем другие производства многих аско...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего разглашать.

Благодарности

Работа в лаборатории автора финансируется Канадским институтом исследований в области здравоохранения, Канада Фонд инноваций, естественным наукам и инженерным исследованиям Совета и Университет Конкордия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Singer MSM System 200МикроскопSinger InstrumentsNA
D-сорбитолРеагентBioShop CanadaSOR508
ТрисРеагентBioShop CanadaTRS001
Zymolyase 100TРеагентSeikagaku Corporation120493
Дрожжевой экстрактРеагентBioShop CanadaYEX401
ПептонРеагентBioShop CanadaPEP 403
D-глюкозаРеагентBioShop CanadaGLU501
Азотистая основа для дрожжей (YNB)РеагентBioShop CanadaYNB406
БиотриптонРеагентBioShop CanadaTRP402
Хлорид натрияРеагентBioShop CanadaSOD002
Ацетат калияРеагентBioShop CanadaPOA 301
АгарРеагентBioShop CanadaAGR003
Сульфат аденинаРеагентBioShop CanadaADS201
L-урацилРеагентBioShop CanadaURA 241
L-триптофанРеагентBioShop CanadaTRP 100
L-гистидинРеагентBioShop CanadaHIS 200
L-аргининРеагентAmresco0877-100G
L-метионинРеагентBioShop CanadaMET 222
L-тирозинРеагентBioShop CanadaTYR 333
L-изолейцинРеагентBioShop CanadaISO 910
L-валинРеагентBioShop CanadaVAL 201
L-лизинРеагентBioShop CanadaLYS 101
L-фенилаланинРеагентBioShop CanadaPHA 302
L-глутаминовая кислотаРеагентBioShop CanadaGLU 202
L-треонинРеагентBioShop CanadaTHR002
L-лейцинРеагентBioShop CanadaLEU 222

Ссылки

  1. Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Диссекция асков дрожжейспаривание гаплоидных и диплоидных клетокпластины для споруляциипереваривание зимолиазоймикроманипуляционный микроскопобработка соком тетрадразделение аскоспоррепликационный посевселективные среды
Препарирование Saccharomyces CEREVISIAE Сумки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.