$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Периферической крови мононуклеарных клеток (PBMC) изоляции
- Получить кровь - кровь должна быть собрана в шприцах или крови труб и анти-коагулируют с гепарином (1:50 соотношение), чтобы предотвратить свертывание крови. Ожидайте выходом около 1 × 10 6 РВМС на мл крови - около 40% из которых будут CD4 положительных (CD4 +) Т-клеток.
- Алиготе крови в 50 мл конические пробирки, 25 мл на трубе. Если кровь отделился, осторожно перемешать до aliquoting распространять плазмы
- Добавить PBS, в результате чего общий объем до 40 мл и легла в основу при составлении 11 мл Ficoll, вставляя в кровь трубки и осторожно удалить пипеткой помощь из пипетки. Ficoll будет медленно стекать в нижней части трубы. Как только уровень выравнивается, медленно удалять пипеткой из крови трубки и выбросьте.
- Cap крови труб и переехать в Aerosolve канистры. Плотно закройте канистры и центрифуге при 900 × г в течение 20 минут - никаких тормозов. Очень важно, чтобы не тормоз в конце этого спина, как тормозная сила не помешает слой клеток.
- После спина, МНПК должны формировать различные белый слой между желтой плазмы (см. выше) и прозрачной Ficoll (см. ниже). Аккуратно скользить от белого слоя клеток крови с помощью пипетки передачи и перехода на новые трубы. Некоторые плазменные и Ficoll может быть составлен с МНПК, но избежать составления любого из красного слоя клеток. Обычно две трубки крови могут быть объединены в одну ячейку трубки на этот шаг, чтобы увеличить размер гранул.
- Добавить PBS, в результате чего общий объем до 50 мл и центрифуге при 500 × г в течение 15 минут - низкая тормозом в aerosolve канистры.
- Аспирацию жидкости, используя пипетку Пастера, стараясь не нарушить гранул
- Лечить с гемолитической буфер добавлением 5-6 мл в каждую пробирку и осторожно смешивания, чтобы удалить сгустки. Инкубируйте в течение не более 5 минут.
- Добавить PBS, в результате чего общий объем до 50 мл и центрифуге при 230 × г в течение 10 минут - низкая тормоза. Aerosolve канистры больше не нужны для этих медленнее спинами.
- Промыть два раза: аспирацию жидкости, используя пипетку Пастера, заполнить трубу с PBS и центрифуге при 230 × г в течение 10 минут.
- До последнего шага вымыть, удалить аликвоту ресуспендировали клетки, разведите трипанового синий, и считать использование гемоцитометра. Этот подсчет клеток будут диктовать объемы реагента используется в стадии разделения Т-клеток.
2. CD4 + Т-клеток отделение *
- Аспирацию жидкости и добавляют работы буфера довести общий объем до 40 мкл на 10 миллионов клеток. Обычно для этого требуется 30 мкл буфера плюс остаточный объем гранул.
- Передача этого объема до 15 мл коническую трубку.
- Добавить антител коктейль из комплекта изоляции CD4 - 10 мкл на 10 миллионов клеток, крышка трубки, и место на льду в течение 10 минут
- Удалите трубку изо льда, снимать крышку и добавить 30 мкл работает буфер на 10 миллионов клеток
- Добавить магнитных гранул из комплекта изоляции CD4 - 20 мкл на 10 миллионов клеток, крышка трубки, и место на льду в течение 15 минут
- Добавить десять томов работает буфер для стирки и центрифуге при 230 × г в течение 10 минут.
- Во время спина, созданная магнитом и 5 мл полипропиленовые трубки на вашем рабочем месте
- Аспирацию жидкости из клеточный осадок, добавляют 2 мл работает буфер и удалить сгустки использованием передачи пипетки
- Используя ту же пипетку передачи, передачи клеток в 5 мл трубку и инкубировать в магнит в течение 15 минут
- Тщательно слейте CD4 + клеток долю в отмеченную 15 мл трубки путем обращения магнита и опорожнения все, кроме последней капли
- Добавить еще 2 мл работает буфер для 5 мл трубку и снимите с магнитом
- Осторожно промыть CD4-клетки по бокам от трубы и передачи отмечен 15 мл трубки
- Добавьте 2 мл Т-клеток среду в каждую пробирку, удалить аликвот для подсчета клеток и центрифуге при 230 × г в течение 10 минут.
- Развести ячейки аликвоты с трипанового синего и считать использование гемоцитометра. Эти клеток будет диктовать, количество скважин для шага культуры расширения.
* Кроме того, MACS колонны и шарики (Miltenyi Biotec), сепаратор AutoMACS клетки (Miltenyi Biotec), или Robosep сепаратор клеток (Технологии стволовых клеток) могут быть использованы в соответствии с инструкциями производит на месте шаги 2.2 - 2.11.
3. В культуре расширения пробирке
- Аспирацию жидкости из CD4 + и CD4-клеток гранулы, и на основе клеток, добавлять питательные среды (обычно 3 млн CD4 + клеток на мл и 10 миллионов CD4-клеток на мл хорошо подходит для создания культуры). Расширение культуры требует 3-5 млн. CD4-клеток на лунку и 2-3 миллионов CD4 + клеток на лунку в общем объеме 1 мл культуральной среды в 48-луночного планшета культуры. Как правило, CD4 + клетки являются предельными населения
- При желании, облучать CD4-клеток (5000 Rad с). Алиготе CD4-клеток в соответствующее число скважин на 48 лунками, добавив 300-500 мкл каждого из них. Место пластины в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа. Приверженцем CD4-клеток будет служить антиген представляющих клеток в расширении культуры.
- Удалите пластину из инкубатора.
- Вымойте скважин путем добавления 500 мкл свежей среды и мягко пипетирования вверх и вниз 12-20 раз, используя передачу пипетки и удаляя все жидкости. Это мытье оставит слой приверженцем антиген представляющих клеток.
- При мытье завершено, добавить ровно столько средств массовой информации к влажной нижней части каждой скважины (примерно 100 мкл) - в противном случае прилипшие клетки высохнет
- Добавить 2-3 млн. клеток CD4 + в каждую лунку. При необходимости добавить дополнительные средства массовой информации довести общий объем в каждой лунке до 1 мл.
- Добавить желаемого пептида в каждую лунку. Типичные концентрации для стимуляции составляет 10 мкг / мл окончательным.
- Место пластины в 37 ° C инкубаторе в течение 7 дней.
- Через 7 дней, добавить 50 мкл Hemogen Ил-2 (или эквивалент, например рекомбинантный IL-2, 10 МЕ / мл) в каждую лунку.
- На каждый последующий день, контролировать рост клеток с помощью микроскопа. Поток скважин, которые еще не сливающийся, удаляя половину средств массовой информации, добавляя свежие средства массовой информации и 50 мкл ИЛ-2. Сплит сливной скважин ресуспендирования клеток, движущихся половине клетки пустыми хорошо, добавляя свежие средства массовой информации и 50 мкл ИЛ-2. Вернуться клетки в инкубатор.
- Расширение клетки будут готовы к тетрамер после 13-15 дней культуры.
4. Визуализация Т-клеток путем окрашивания тетрамер
- Покупка или собираться тетрамеров, чтобы соответствовать пептида / МНС комбинации, которые соответствуют стимулировали CD4 + Т-клеток (см. обсуждение на источники тетрамер реагентов). Тетрамеров должна быть ~ 0,5 мг / мл раствора.
- Удалить пластины из инкубатора
- Аккуратно оттянуть половину средств массовой информации из каждой лунки
- Передача аликвоту клеток из каждой лунки - как правило, 75 мкл, или около 50 тысяч клеток - в 5 мл трубки полистирола FACS
- Добавить тетрамер - как правило, 1 мкл на 50 мкл общий объем - и место в 37 ° С инкубатор на 1-2 часа. Кроме того, целесообразно, чтобы окрасить второй аликвоту клеток из каждой лунки с несоответствующие тетрамер в качестве отрицательного контроля.
- Этикетка клетки с анти-CD3, анти-CD4, и анти-CD25 антитела, добавив 3-10 мкл каждого антител. Дополнительные или альтернативные маркеров антитела могут быть использованы. Однако, не используйте PE меченых антител, так как это канал должен быть зарезервирован для тетрамеров. В это время, а также этикетки одного управления цветом или изотипа использованием дополнительных элементов.
- Инкубируйте антител меченых клеток в течение 15-30 минут на льду или при температуре 4 ° C.
- Промыть каждую пробирку с 0,5 до 2 мл буфера и работает центрифуге при 230 × г в течение 10 минут.
- Тщательно слейте жидкость из трубы СУИМ. Храните все трубы в закрытой емкости (желательно на лед) для последующего анализа FACS.
5. Поток Приобретение Цитометр и анализа
- Калибровка потока Цитометр с использованием эталонных бисером.
- Проверьте настройки прибора:
- Использование неокрашенные клетки управления или изотипа контроля, откорректировать местоположение жизнеспособной ворота лимфоцитов (ФСБ против SSC). Удалить авто-флуоресценции всех каналов на центрирования населения (путем изменения коэффициента усиления настройки) ниже первого десятилетия на каждой оси.
- Использование одного цвета контроля труб, в центре событий в правильном квадранта для каждого отдельного цвета (путем изменения компенсацию настроек).
- У тонкой настройки параметров с помощью инструмента трубки окрашиваются не имеет значения тетрамер. В специальные установки для PE канал может нуждаться в корректировке, поскольку тетрамеров часто пятна ярче, чем антитела контроль. Не имеет значения тетрамер должны пятно <0,5% CD4 + клеток.
- Сбор данных для каждой трубки
- Сбор событий для каждой трубки образца и отрицательные трубки контроля
- Приобретение и спасти по крайней мере 20 тысяч мероприятий для Analysys
- Анализ данных
- Импорт данных файлов в FACS анализ программного обеспечения (например CellQuest программного обеспечения, WinMDI или FlowJo). Начните анализ с использованием трубки окрашивали не имеет значения тетрамер.
- Участок ФСБ против SSC и сделать ворота вокруг живых лимфоцитов (рис. 1, верхняя левая панель).
- Участок CD4 против CD3 (закрытый показать жить только лимфоциты) и нарисуйте вокруг ворот CD3 + и CD4 + популяции (рис. 1 верхняя правая панель).
- Участок CD4 против тетрамер (закрытый показать CD3 + лимфоцитов только) и установить квадрант границы так, что CD4 + + тетрамер населения составляет менее 0,5% (рис. 1 нижняя левая панель).
- Участок CD25 против тетрамер (закрытый показать CD4 + лимфоцитов только) и установить квадрант границы так, что CD25 + + тетрамер населения составляет менее 0,5% (рис. 1 нижняя правая панель).
- Анализ всех пробирок с образцами без изменения ворота.
1167/JOVE% 20FIGURE% 201.png "ALT =" Рисунок 1 "ширина =" 600 "высота =" 342 "/>
Рисунок 1. Представителю отрицательные результаты тетрамер контроль окрашивания. Верхняя левая панель показывает вперед разброс стихи разброс стороны и лимфоцитов ворота размера (R1). Верхнем правом углу панели закрытого для R1 и показывает, муравей-CD4 по сравнению с анти-CD3 и CD3 + (R2) и CD4 + (R3) ворота. Нижней левой панели закрытого для R2 и показывает анти-CD4 по сравнению с тетрамер. Нижней правой панели закрытого для R3 и показывает, анти-CD25 против тетрамер. Квадранта для обоих участков тетрамер были настроены на 0,5%.
6. Представитель Результаты
- Тетрамер позитивные клетки должны быть различны населения среди расширен CD4 + клеток (рис. 2).
- Тетрамер положительных клеток, как правило, CD25 + и CD4 часто высока.
- В некоторых случаях, MHC / пептид сочетание может дать фоне окрашивание (часто вызванные пептид с плохой растворимостью). Такое окрашивание фона можно отличить от истинного положительным моментом, поскольку "ложное срабатывание" клетки не одно отличие населения по обе CD4 против тетрамера или CD25 против тетрамер участков (рис. 3).
Рисунок 2. Представителю положительный результат окрашивания тетрамер. Расположение панели и литниковой стратегии идентичны рисунке 1. Тетрамер позитивные клетки появляются в качестве отдельной CD4 высокой населения на анти-CD4 по сравнению с тетрамер панели и различные CD25 + популяции на анти-CD25 против тетрамер панели.
Рисунок 3. Представитель "ложноположительные" результаты тетрамер окрашивания. Расположение панели и литниковой стратегии идентичны рисунке 1. Анти-CD4 по сравнению с панелью тетрамера показывает нечеткие "насыпью" окрашивания. Анти-CD25 против тетрамера показывает также, "насыпью" окрашивания, без четкой тенденции к будучи CD25 +.