Методическая статья

Измерение экзоцитоза в Нейроны Использование FM-маркировки

DOI:

10.3791/117

⸱

30 ноября 2006 г.

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, Harvard

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможность измерения кинетики пузырьков релиз может помочь дать представление о некоторых основах нейротрансмиссии. Здесь мы использовали в режиме реального времени изображения пузырьков помечены красным флуоресцентным красителем FM 4-64 для измерения скорости пресинаптическое высвобождение пузырьков в гиппокампе нейронов культур.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможность измерения кинетики пузырьков релиз может помочь дать представление о некоторых основах нейротрансмиссии. Здесь мы использовали в режиме реального времени изображения пузырьков помечены FM краситель для контроля скорости пресинаптическое высвобождение пузырьков. FM4-64 представляет собой красный флуоресцентный амфифильных стирил краситель, который встраивается в мембраны синаптических пузырьков как эндоцитоза стимулируется. Липофильные взаимодействия причиной красителя значительно увеличить флуоресценции, таким образом, излучающие яркий сигнал, когда связанные с пузырьками и номинальной, когда во внеклеточной жидкости. После мытья шаг используется, чтобы помочь устранить внешние красителя в плазме мембраны, оставшиеся FM сосредоточен в пузырьках, а затем изгнали когда экзоцитоза индуцирована очередной раунд электрической стимуляции. Скорость выделения пузырьков измеряется от последующем снижении флуоресценции. С FM красителя может быть применено внешнее и скоротечно, это полезный инструмент для установления ставок экзоцитоз в нейрональных культурах, особенно при сравнении ставок между трансфицированных синапсов и соседних boutons контроля.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки: Крыса (или мыши) первичных нейронов гиппокампа культур (14-28 дней в пробирке).

Стимуляция: Электрическое, доставляется через двумя платиновыми электродами; 70-90 мВ

Микроскопия: 60x объектив нефти на перевернутую ПЗС-флуоресцентного микроскопа.

Программное обеспечение: Slidebook (Intelligent изображений Инновации, Санта-Моника, Калифорния)

Смотрите дополнительную страницу методы подробности

  1. Теплый HEPES-солевой буфер (ОБД) до комнатной температуры. Добавить глютамат рецепторов APV (50 мкМ конечной концентрации) и CNQX (10 ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как 300 потенциалов действия (AP) является достаточным, чтобы вызвать по меньшей мере один раунд пузырьков переработки, загрузки стимулом 300 точек или более часто дают этикетку переработки пул везикул. Хотя более интенсивной загрузки стимулы, такие как 900 точек доступа, может позволить номинальный ряд дополнительных пузырьков, подлежащих маркировке, это также увеличивает количество времени красителя можете вставлять во внеклеточной оболочки, что ведет к повышению неспецифического окрашивания. Я обнаружил, мыть шаг к иметь решающее значени.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АПВSigma-AldrichA5282
FM 4-64Молекулярные зонды, Life TechnologiesT-3166
динатриевая соль CNQXSigma-AldrichC-239

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FM

Похожие статьи