Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 3

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/1170

⸱

13 апреля 2009 г.

 ,  , 
1Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 3 описывает процесс флуоресцентно маркировки усиливается РНК из хозяина и вирусных образцов аминокислот аллилового связи красителей. Часть 3 из 3.

Протокол

Часть 1: Арна маркировки: аминокислоты связи аллил из красителей

  1. Добавить 1 мкг образцов Арна в 1,5 мл труб микроцентрифужных.
  2. Вакуумные сухие образцы на низкой или нулевой температуре, пока они полностью не высохнут. Cap каждой трубки, как только она сухая - не пересушить!
  3. Добавить 9μl связи буфера в каждую пробирку и ресуспендируйте Арна, осторожно вортексе в течение 1 минуты. Центрифуга кратко собрать образец в нижней части трубки, а затем дать образец сидеть на льду.
  4. Добавить 22μl высокой ДМСО качества для каждой трубки Cy3 или Cy5 красителя. Один трубку краситель достаточно для 2 образцов. Красителя Cy3 для маркировки вашего эталонных образцов, и краситель Cy5 для маркировки ваши образцы тестов.
  5. Vortex красителей тщательно перемешать. Держите красителей в темноте, пока готов к использованию. Не готовьте красителя ранее чем за 1 час перед использованием. Убедитесь, что вода не попадает в красителях / ДМСО смесь в любой момент.
  6. Добавить 11μl подготовленных ДМСО / Су краситель для каждого образца. Хорошо перемешайте на вортексе мягко.
  7. Инкубируйте в течение 30-45 минут при комнатной температуре. Обложка образцы с фольги или держать их в ящик, чтобы минимизировать воздействие света.
  8. После инкубации, добавьте 4.5μl hydroxlyamine для каждого образца, чтобы утолить реакции. Хорошо перемешайте на вортексе мягко.
  9. Инкубируйте в течение еще 15 минут при комнатной температуре. Обложка образцы с фольги или держать их в ящик, чтобы минимизировать воздействие света.

Часть 2: Маркированный Арна очистке

  1. Vortex связывание РНК бисером кратко получить даже смесь перед использованием.
  2. Подготовка Арна Связывание Смешать при комнатной температуре. (Табл. 1)
  3. Хорошо перемешайте на вортексе.
  4. Aliquote буфера Арна Элюирование в 1,5 мл трубки и инкубировать при 50-60 ° С в течение не менее 10 минут.
  5. Добавить 70μl из Арна обязательным смеси для каждого образца и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
  6. Передача образца от пластины ПЦР для 96-луночного круглым дном тарелку.
  7. Добавить 50 мкл 100% изопропанола к каждому образцу и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
  8. Осторожно встряхните пластину на орбитальный шейкер, по крайней мере 2 минуты для тщательного перемешивания образцов.
  9. Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус. Оставьте пластину на стенде, пока смесь не станет прозрачной и обязательным бисера гранулированный.
  10. Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант. Супернатант должен быть либо ярко-розовый или ярко-голубые на данный момент из-за неинкорпорированных молекул красителя.
  11. Удалите пластину из магнитного стенда.
  12. Добавить 100 мкл Арна промывочного раствора в каждую лунку и встряхните пластине в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при умеренной скорости. Бусины могут не расходиться на этот шаг.
  13. Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус.
  14. Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант.
  15. Удалите пластину из магнитного стенда.
  16. Повторите мыть 2-й раз с 100 мкл промывочного раствора Арна.
  17. После 2-й вымыть, обсушить бисером встряхиванием пластины в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при максимальной скорости. Не пересушить образцы!
  18. Элюировать Арна из бисера, добавляя 20 мкл предварительно нагретую Элюирование Арна буфера для каждого образца.
  19. Энергично встряхните пластину на орбитальном шейкере в течение 3 минут, а затем проверить, чтобы убедиться, магнитных шариков полностью рассеялись. Если нет, то продолжать дрожать.
  20. После магнитных шариков полностью рассеяны, перемещать пластину магнитного стоять, чтобы захватить магнитных шариков. Супернатант содержит в порядок, помечены образцы Арна, и должно быть или бледно-розового или бледно-голубым.
  21. Тщательно передачи элюировали Арна к новой пластинкой ПЦР (или ПЦР).
  22. (Необязательный шаг) Проверьте концентрацию РНК и количество красителя в образцах путем измерения 1.5μl на NanoDrop спектрофотометр использования Microarray модуля.
  23. Сразу гибридизации меченых Арна на микрочипов платформы на ваш выбор, или в качестве альтернативы, вы можете хранить помечены Арна при -80 ° С, пока вы не готовы к гибридизации.

Таблица 1 Арна Связывание Mix

Реагент Сумма за 1 реакция
Связывание РНК бисер * 10 мкл
Бусы ресуспендирования Решение * 4μl
100% изопропанола ** 6μl
Арна Связывание Концентрат буфера 50 мкл

* Смешать связывание РНК бисер сбусинка ресуспендирования решение первой
** Добавьте изопропанола и хорошо перемешать перед добавлением Арна обязательным концентрат буфера.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические Шаги

При выполнении аминокислоты аллилового связи, очень важно для ресуспендирования красителя в ДМСО незадолго (менее 1 часа), прежде чем связь и убедиться в отсутствии воды попадает в красителях / ДМСО смеси, как он будет реагировать с активными группы по красителя. Не пересушивать РНК (можно высушить до 1-2UL, а не полностью высохнет), а также ресуспендируют в связи буфера. Во время реакции сочетания, держать реакции в темноте, с редкими и стряхивая со спином вниз по желанию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Уайтхед Институт стипендиаты фондов

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор активных красителей CyDye для пост-маркировкиРеагентGE HealthcareRPN5661Содержит красители Cy3 и Cy5
УФ-видимый спектрофотометр NanoDrop ND-1000ПрочееNanoDropND-1000Или эквивалентный спектрофотометр

Ссылки

  1. Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
  2. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
  3. Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
  4. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
  5. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
  6. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
  7. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
  8. Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

HeLaNanoDrop
Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 3
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.