Мы опишем простой протокол для идентификации белков мозга, которые связывают с полной конечной длины C АТФ закрытого P2X2 рецепторов. Расширение и систематическое применение этого подхода ко всем Р2Х рецепторов, как ожидается, приведет к лучшему пониманию сигнализации рецептора Р2Х.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Протеомики для идентификации белков Взаимодействие с P2X2 лиганд-Gated Каналы Катионит
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Лиганд-ионные каналы лежат в основе синаптической связи в нервной системе 1. У млекопитающих Есть три семейства лиганд закрытого канала: цис цикла, глутамат-закрытого типа, и Р2Х каналов рецепторов 2. В каждом случае связывания передатчика приводит к открытию поры, через которые ионы стекают их электрохимического градиента. Многие лиганд-закрытый каналы также проницаемой для ионов кальция, 3, 4, которые ниже по течению сигнализации ролей 5 (например, регуляции генов), которые могут превышать длительность канал открытия. Таким образом лиганд закрытого канала может сигнализировать о более широком масштабе времени от нескольких миллисекунд до нескольких дней. Учитывая эти важные роли надо понять, как лиганд закрытого ионных каналов сами регулируются белками, и как эти белки могут настроить сигнализацию. Последние исследования показывают, что многие, если не все, каналы могут входить в состав белка сигнализации комплексы 6. В этой статье мы объясним, как идентифицировать белки, которые связываются с С-концевой аспекты P2X2 рецептор цитозольного домена.
Р2Х рецепторы АТФ-каналов закрытого катионов и состоит из семи подразделений (P2X1-P2X7). Р2Х рецепторы широко выражается в головной мозг, где они посредником возбуждающие синаптической передачи и пресинаптического облегчения нейромедиатора выпуска 7. Р2Х рецепторы находятся в возбудимых и не возбудимых клеток и посредником ключевую роль в нейронной сигнализации, воспаление и сердечно-сосудистой функции 8. P2X2 рецепторы широко распространены в нервной системе, а 9 находятся в центре внимания данного исследования. Каждая субъединица Р2Х, как полагают, обладают двумя мембрану сегментов (TM1 и TM2), разделенных внеклеточной области 7 и внутриклеточных N и С, концы (рис. 1а) 7. Р2Х подразделения 10 (P2X1-P2X7) показывают 30-50% последовательность гомологии на уровне аминокислот 11. Р2Х рецепторы содержат только три подразделения, что является самым простым стехиометрии среди ионотропных рецепторов. P2X2 С-конца состоит из 120 аминокислот (рис. 1б) и содержит несколько сайтов стыковочного белка консенсуса, в пользу гипотезы, что P2X2 рецепторов может быть частью сигнализации комплексов. Однако, несмотря на несколько функций были отнесены к С-конце P2X2 рецепторов 9 ни одно исследование не описаны молекулярные партнеров, которые пару к внутриклеточной стороне этого белка по всей длине C-конца. В этой статье мы опишем методы протеомных подход к определению белков, которые взаимодействуют с полной длины С-конце P2X2 рецепторов.
Протокол
Экспериментальных процедур
Методика эксперимента (рис. 2) состоит из четырех частей, которые описаны в поэтапно ниже.
Часть 1: Субклонирование и выражение С-конце P2X2 рецепторов.
Мы выразили полную длину С-конце P2X2 рецепторов у бактерий для идентификации белков мозга, к которым она связывает.
- С-концом (остатки 353-472) из P2X2 рецепторов (рис. 1) был усилен с помощью ПЦР, клонировали в pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) и проверяться с помощью секвенирования.
- Рекомбинантная плазмида была преобразована в E. Coli (BL21) для экспрессии рекомбинантных белков.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Ионные каналы являются одной из основных класса интегральных мембранных белков. Они содержат заполненных водой поры, избирательно разрешить перемещение ионов вниз их электрохимического градиента через плазматическую мембрану. Ионные каналы ворота между открытым и закрытым состояниями. Стробирования шаг вызван передатчиков (например, АТФ) в случае Р2Х лиганд ионные каналы, или она может регулироваться взаимодействие с другими белками. Последнее десятилетие наблюдался рост в нашем понимании того, как Р2Х рецепторов связыв.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
SW и ВТМ поддерживаются NCRR и NHLBI в Национальном институте здравоохранения. БСК и HS поддерживает NINDS и NIGMS Национального института здоровья.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Ацетонитрил | Реагент | JT Baker | 9829-02 | |
| Акриламид | Реагент | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ампициллин | Реагент | VWR international | VW1507-01 | |
| Бикарбонат аммония | Реагент | Fluka | 09830 | |
| Персульфат аммония (APS) | Реагент | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Аденозинтрифосфат (ATP) | Реагент | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Реагент Брэдфорд | Реагент | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Бромфеноловый синий | Реагент | Fisher Scientific | B-392 | |
| Кумасси синий R-250 | Реагент | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Диттиотреитол (DTT) | Реагент | EMD Millipore | 3860 | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) | Реагент | VWR international | VW1474-01 | |
| Этиленгликольтетрауксусная кислота (EGTA) | Реагент | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Муравьиная кислота | Реагент | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Сорбиты с глутатион-сефарозой 4B | Реагент | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Соляная кислота (HCl) | Реагент | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид (IPTG) | Реагент | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Йодоацетамид | Реагент | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Среда Луриа-Бертани (LB) | Реагент | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Лейпептин | Реагент | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Лизоцим | Реагент | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Сульфат магния (MgSO4) | Реагент | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Хлорид натрия (NaCl) | Реагент | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Фторид натрия (NaF) | Реагент | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Ортованадат натрия (Na3VO4) | Реагент | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Реагент | Fluka | 74385 | |
| Фенилметилсульфонилфторид (PMSF) | Реагент | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Таблетки с ингибитором протеаз | Реагент | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Стандарт белка | Реагент | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Саркозил | Реагент | Acros Organics | 61207 | |
| Виала с завинчивающейся крышкой | Инструмент | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Додецилсульфат натрия | Реагент | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Краситель для белков в геле SYPRO® Ruby | Реагент | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин (TEMED) | Реагент | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris-основание | Реагент | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Реагент | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Трипсин | Реагент | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Реагент | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Вода | Реагент | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| Тандемный масс-спектрометр LTQ-Orbitrap | Инструмент | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Система наножидкостной хроматографии | Инструмент | Eksigent | ||
| β-меркапто–этанол | Реагент | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Глицерин | EMD Millipore | GX0185-6 |
Ссылки
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contr....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
