Методическая статья

ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

13.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/118

⸱

30 ноября 2006 г.

 ,  ,  , 
1McLean Hospital, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Вывод нейроэпителиальных предшественников из эмбриональных стволовых (ЭС) клеток с использованием стромальных клеток-производных вызывающие активность (SDIA).

Аннотация

ЭС клетки обладают потенциалом дифференцироваться в клетки всех зародышевых листков, что делает их привлекательным инструментом для разработки новых методов лечения. В общем, дифференцировку ЭС клетки придерживается концепции сначала подготовить незрелых клеток-предшественников, которые затем могут быть распространены и дифференцировались в зрелых клеточных фенотипов. Это относится и к ЭСК полученных нейрогенез, в котором развитие нервных клеток является продолжением двух основных этапов: Во-первых, вывод и расширения незрелых нейроэпителиальных прекурсоров и во-вторых, дифференциация их в зрелые нервные клетки. Распространенным методом для производства нейронных прародителей из ЭС клеток основана на эмбриоидных тела (EB) образование, которое показывает, дифференцировки клеток от всех зародышевых листков в том числе нейроэктодермы. Альтернативный и более эффективный метод, чтобы побудить нейроэпителиальных развития клетка использует стромальных клеток-производных вызывающие активность (SDIA), которая может быть достигнута путем совместного культивирования ЭС клетки и черепа костномозгового происхождения стромальных клеток (1). Оба, Е. Б. формирования и SDIA, показывают развитие розетка-подобных структур, которые, как считается, напоминают нервной трубки и / или нервного гребня, как прародителей. Нейронных прекурсоров может быть изолирован, расширение и дальнейшее дифференцировались в специфических нейронов и глии клеток с использованием определенных условиях культуры. Здесь мы описываем поколения и изоляции таких розетки во взаимодействии культуры эксперименты с стромальных клеточных линий MS5 (2-5).

Протокол

Шаг 1

  1. Пластина митомицин-С ggrowth-тормозится (10 мкг / мл в течение 2,5 часов) MS5 клеток при плотности 70000 / см2 на желатин покрытием (0,01% в течение 30 минут) 6 луночных планшетах в α-MEM СМИ.
  2. Когда клетки прикрепляются и образовали монослоя (за одну ночь роста), переключиться на SRM.
  3. Вручную изолировать колонии ЭСК из ES культурах клеток с помощью шприца с 27 ½ G иглы.
  4. Tritrurate колонии тщательно с 1 мл синий наконечник и пластины при низкой плотности на MS5 клетки (обычно 2-3 колоний на 6-луночный планшет).

Примечание: ЭС клетки могут быть взяты из ферментативных распространения с применением коллагеназы или трипсина.

Шаг 2

  1. Расти ЭС клеток на MS5 питателей в течение 14-21 дней, пока розетки содержащих образуют колонии.


Примечание: Изменение СМИ часто. Розетки, как правило, на внешних краях колоний и их образование может быть значительно повышена, если 300-500 нг / мл Ноггин добавляется в SRM (3). В некоторых дифференциация протоколы, SRM можно обменять на N2-медиа и дополнены роста или другие факторы, чтобы способствовать ячейки спецификации (2-5).

Шаг 3

  1. Изолировать и подобрать розетки с 27 ½ G иглу под микроскопом.

Примечание: Не резки и выбрать MS5 стромальных клеток. Если колонии упакованы с розетками, можно также выделить всю колонию.


Шаг 4

  1. Аспирируйте кластеров розетки, tritrurate их тщательно с 1 мл синий наконечник, и пластины их на поли-L-орнитин (0,001%) и фибронектина (1 мкг / мл) или ламинин (1 мкг / мл) покрытием 6 скважин в N2-СМИ обычно дополнены bFGF (20 нг / мл). Розетки будут реформировать и расширить.

Примечание: Для повышения выживаемости клеток, можно пластины малых кластеров в каплях увеличить плотность клеток. Этот шаг также может быть изменена путем дополнения N 2-СМИ с дополнительным ростом или другие факторы, чтобы способствовать ячейки спецификации (2-5).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол демонстрирует различные этапы в создании и изоляции нейроэпителиальных клеток из человеческих клеток ES использованием SDIA. Применение этого метода состоит в многообразии и была использована во многих протоколов для производства указанных нейронов (например, 1, 2, 5-9). Розетки, как полагают, напоминают нервные клетки трубки с передней фенотип (2, 5, 10), а также содержат нейронных прародителей гребне (11, 12). Кроме того, они сохраняют определенный уровень пластичности, так как они могут быть составлены по образцу конкретных...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
L-глутаминGIBCO, от Life Technologies25030
$\alpha$-MEMGIBCO от Life Technologies12571
Пенициллин/стрептомицинGIBCO, от Life Technologies15140
DMEM без нуклеозидов (Knockout-DMEM)GIBCO, производства Life Technologies10829
Заменитель сыворотки KnockOutGIBCO, от Life Technologies10828
раствор незаменимых аминокислот MEMGIBCO, производства Life Technologies12383
DMEM/F12GIBCO, компания Life Technologies11330
добавка N2-AТехнологии стволовых клеток07152
Митомицин-СSigma-AldrichM0503
Желатин типа АSigma-AldrichG1890
поли-L-орнитинSigma-AldrichP49570,01% раствор
ЛамининSigma-AldrichL-2020
ФибронектинSigma-AldrichF2006
Основной фактор роста фибробластов (bFGF)Invitrogen13256
Шприц объемом 1 мл с иглой 27 1/2 GBD Biosciences309623
среда N2-Aсредасреда DMEM/F12 + 1% добавки N2-A
Среды, заменяющие сыворотку (SRM)средаKnockout-DMEM + 20% заменитель сыворотки Knockout + 1% раствор незаменимых аминокислот MEM + 2 мМ L-глутамина
αсреда MEMсредаα-MEM + 10% FBS + 2 мМ L-глутамина + 1% пенициллина/стрептомицина
МС5линия клетокстромальные клетки
Микроскоп
Планшеты на 6 лунокдля культивирования тканей

Ссылки

  1. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
  4. Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
  5. Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
  6. Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
  7. Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
  8. Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
  9. Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
  10. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  11. Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
  12. Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MS5

Похожие статьи