Обработка Лоблолли Пайн PtGen2 кДНК Microarray

Summary

КДНК микрочипов PtGen2 был разработан для изучения экспрессии генов в ладанной сосна, П. taeda, И других хвойных пород. Здесь мы покажем, пре-и пост-гибридизация обработки и мытья методов, которые могут быть использованы с этого массива для получения лучшей консистенции, снижение артефактов, и нижний фон.

Abstract

PtGen2 это 26496 особенность кДНК микрочипов содержащие усиливается ЭБТ ладанной сосны. Массива производится в нашей лаборатории для исследователей изучения экспрессии генов в сосны и других хвойных пород. PtGen2 была разработана как результат наших генов открытие усилия в ладанной сосна, и состоит из последовательности определены в основном из ткани корней, но и от иглы и стебля. ^1,2 PtGen2 была проверена путем гибридизации различных Су-красителя помечены кДНК хвойных целевой , используя как усиливается и без усилителей косвенных методов маркировки, а также протестированы с числом гибридизации и стиральные условиях. Это видео фокусируется на обработке и переработке слайды до и после предварительной гибридизации, а также после гибридизации, используя некоторые изменения в процедуры, разработанные ранее. ^3,4 Также, в текстовом виде только в протоколах, используемых для производства, маркировки и очистки целевых кДНК с, а также информацию о программном обеспечении, используемом для последующей обработки данных.

PtGen2 печатается с собственной буфера печати, содержит высокую концентрацию солей, которые могут быть трудно удалить полностью. Слайды промывают сначала в теплом растворе SDS до предварительно гибридизации. После предварительного гибридизации, слайды моют энергично в нескольких сменах воды до полного удаления оставшихся солей. LifterSlips ™ затем очищается и устанавливается на слайды и помечены кДНК тщательно загружены на микрочипов путем капиллярного действия, который предусматривает равномерное распределение по всей образец слайдов, а также снижает шансы пузырь регистрации. Гибридизация целей для массива осуществляется на 48 ° C в условиях повышенной влажности. После гибридизации серии стандартных моет выполняются на 53 ° C и комнатной температуре в течение длительного времени. Обработка PtGen2 слайды с помощью этой техники уменьшает соль и SDS-производные артефакты часто видел, когда массив обрабатывается менее строго. Гибридизации цели основе нескольких различных хвойных источников РНК, эта обработка протокола дали меньше артефактов, снижение фона, и обеспечивает более полный согласованности между различными экспериментальными группами массивов.

Protocol

(Обратите внимание, Разделы 1 - 4 не продемонстрировали в видео)

Подготовка Су-Маркированный целевых кДНК

Далее следует протокола мы используем для синтеза кДНК из ладанной сосна общей РНК и косвенных кДНК маркировки до микрочипов гибридизации. Хотя некоторые нетривиальные изменения были сделаны, протокол Ниже же, как в инструкции обеспечены Надстрочный Косвенные Invitrogen в кДНК Kit маркировки.

Часть 1: Первая цепь кДНК реакции синтеза

1. Смешать и кратко спина каждый комплект компонентов перед использованием.
2. Подготовка реакции следующим образом:
   • Xμl DEP....

Discussion

PtGen2 является недавно разработанный, пользовательские кДНК микрочипов, который был предназначен для использования прежде всего научного сообщества сосны ладанной. Предварительные результаты, полученные к настоящему времени показали, массив будет ценным инструментом в оценке транскрипционных событий, которые происходят в ответ на засухи, а также в мониторинге изменений, которые происходят во время развития эмбриона в приморской сосны, Pinus приморская сосна ^5,6 У нас есть Кроме того, недавно показал.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
буфер			для предварительной гибридизации	5X SSC, 0,1% SDS, 1% буфер для
гибридизации				30% формамид, 5X SSC, 5X Denhardt' s, 1% PolyA РНК (Invitrogen, POLYA. GF), 0,1% SDS
Раствор для стирки #1	Буфер			1X SSC, 0,2% SDS, разогреть до 43° C
Раствор для промывки #2	Буфер			0,1X SSC, 0,2% SDS
Раствор для промывки #3	Буфер			0,1X SSC
Реагент изопропилового спирта		Sigma-Aldrich	34959-2,5L
50 мл Конические пробирки	другие	Falcon BD	352070
15 мл Конические пробирки	другие	Falcon BD	352196	Используйте эту или аналогичную крышку, размещенную на дне каждой конической пробирки объемом 50 мл во время центрифугирования
Coplin Jar		Wheaton	900520
Staining Dish & Rack	Other	Wheaton	900200
Альбумин из бычьей сыворотки (BSA)	Другой	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA. GF
SuperScriptTM Набор для непрямого мечения кДНК		Invitrogen	L1014-02
Набор турбоДНКазы		Ambion	AM1907
Система
Cy-5 Краситель	Реагент	GE Healthcare	PA25001
Cy-3 Краситель		GE Healthcare	PA23001
ЛифтерСлипы™	Другое	Erie Scientific	25X601
HybChambers		GeneMachines	JHYB200003