Гросс и изобразительных Препарирование Внутреннее ухо Сенсорные эпителия у взрослых данио рерио ( Danio rerio)

Краткое содержание

Внутреннее ухо чувствительного эпителия взрослых данио является хорошей модельной системой для понимания механизмов волосы регенерации клеток у взрослых позвоночных. Этот протокол демонстрирует прекрасный рассечение эпителия, через который мы можем получить образцы тканей для изучения регенеративных событий на клеточном и субклеточном уровнях.

Аннотация

Нейросенсорная эпителия внутреннего уха являются ключевой структуры для слуха и равновесия функций. Таким образом, важно понимать, клеточном и молекулярном особенности эпителия, которые в основном состоят из двух типов клеток: волосковых клеток (УВ) и опорных клеток (ПК). Здесь мы выбираем для изучения внутреннего уха сенсорно эпителии у взрослых данио не только потому, эпителиальных структур хорошо сохранились и у всех позвоночных изучены, но и потому, что взрослые данио способен к регенерации УВ, возможность, что млекопитающие теряют вскоре после рождения. Мы используем внутреннего уха взрослых данио в качестве модельной системы для изучения механизмов внутреннего уха HC регенерации у взрослых позвоночных животных, которые могли бы быть полезными для клинической терапии слуха / баланс дефицита в человеческом, в результате потери HC.

Здесь мы показываем, как это сделать общей и мелкой вскрытия внутреннего уха сенсорно эпителия у взрослых рыбок данио. Валовой рассечение удаляет тканей, окружающих внутреннее ухо и полезно для подготовки срезов ткани, что позволяет нам изучить детальную структуру сенсорного эпителия. Штрафа рассечение очищает не-сенсорно-эпителиальные ткани каждого отдельного эпителия и позволяет рассматривать неоднородность целом эпителий легко в целом монтажа эпителиальных образцов.

Протокол

Часть 1: Подготовка ткани

1. Эвтаназии взрослых данио с буфером MS-222 (3-этил аминобензоат метансульфонат соли, 0,03%).
2. Обезглавьте рыбы. Отрежьте нижнюю челюсть, место голову на вскрытии пластины с вентральной стороной вверх, и иммобилизации ткани насекомых булавками. Удаление мягких тканей брюшной части черепа и трещины открыты вентральной части черепа капсула с парой тонких пинцета под рассечение микроскопом.
3. Fix рыбы голову в параформальдегида (4%) при температуре 4 ° С в течение ночи.
4. Промыть фиксированной голове рыбы в PBS (фосфатно-солевым буфером, 1X) в течение 3 раза, 5 минут каждый раз.

Часть 2: Валовой рассечение внутреннего уха

1. Место рыбы голову на вскрытии пластины с вентральной стороной вверх. Остановите его с насекомыми булавки. Все следующие шаги осуществляются по рассечение микроскопом.
2. С парой тонких пинцет, удалите кости черепа над внутреннего уха и затем осторожно вытащить внутренние ткани уха: мешочки, lagenae и utricles. Мешочек и лагены плотно приложить друг к другу и, таким образом вытащить вместе, маточки (впереди мешочек и лагены), будет, скорее всего, быть отделена от других органов конца во время вскрытия.
3. Положите внутренние ткани уха в PBS (1X). Если никаких дальнейших штраф вскрытия необходимо, промойте ткань 2-3 раза с PBS (1X) и может быть использован для других экспериментах, например cryosections.

Часть 3: Fine рассечение внутреннего уха сенсорно эпителия

1. Штрафа рассечение может быть проведено в капле PBS (1X) на чистую предметное стекло.
2. Удалить утрикулярных отолитовой от маточки с двумя парами штраф пинцет, и, при необходимости, обрезать без сенсорного эпителиальных тканей и иннервации из эпителия с парой тонких пинцет и иглу лезвия.
3. Удалить лагенарной отолитовой перед отделением саккулярной и лагенарной эпителия в то время как попытаться сохранить весь мешочек, как нетронутыми, насколько возможно. Место ткани в раскрывающемся PBS с вентральной стороной вверх. Используйте иглу лезвие аккуратно надрезать между мешочек и лагены. Аккуратный от чрезмерного без сенсорного эпителиальной ткани и innvervation с мелкими пинцет и иглу лезвие, если это необходимо.

Часть 4: Флуоресцентный окрашивание волос клеток в эпителии сенсорные

1. Промыть сенсорных эпителия с PBT (1XPBS и 1% Тритон Х-100) 3 раза, 5 мин каждый раз.
2. Инкубируйте эпителия с fluophore меченных фаллоидином (например, Alexa Мука 488 фаллоидином, 1:1000 разбавления) в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Промыть сенсорных эпителия с PBT 3 раза, 10 мин каждый раз.
4. Горы эпителия на слайд с монтажными средних и проверить окрашенные ткани под флуоресцентный микроскоп с фильтрами надлежащей длины волны.
5. После успешного вскрытия и окрашивания, нетронутыми эпителия с сильными окрашивания ячейки пучок волос можно увидеть под микроскопом (рис. 1).

Рисунок 1. Волосы клетки саккулярной сенсорного эпителия окрашивали Alexa Мука 488 фаллоидином (зеленый). Образец ткани была расчленена и окрашенных как указано в статье. Некоторые снимки были сделаны при разных положениях образца и черепичные вместе с Adobe Photoshop 7.0.
Шкала бар = 150 мкм.

Обсуждение

В этом протоколе, мы описали общей и мелкой рассечение внутреннего уха сенсорно эпителия взрослых данио, которая позволяет нам подготовить образец ткани для изучения клеточных и субклеточных особенностей сенсорного эпителия.

Для того, чтобы осуществлять успешное вскрытие, самый первый шаг, фиксация, это очень важно. Убедитесь, что вы всегда использовать свежеприготовленный параформальдегида решение, потому что старое решение приведет в возрасте до фиксации тканей, которые трудно управлять во...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
MS222 (метансульфонат этил-3-аминобензоата)	Реагент	Sigma-Aldrich	A5040
PBS (фосфатно-солевой буфер, 10X)	Реагент	Mediatech, Inc.	46-013-CM
Параформальдегид	Реагент	Sigma-Aldrich	P-6148
Triton X-100	Реагент	Sigma-Aldrich	T8787
Alexa Fluor 488 фаллоидин	Реагент	Invitrogen	A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium с DAPI (среда для заключения препаратов)	Реагент	Vector Laboratories	H-1500
Диссекционный микроскоп	Микроскоп	Nikon Instruments	SMZ1000
Энтомологические булавки	Инструмент	Fine Science Tools	26000-40
Ножницы	Инструмент	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Пинцет	Инструмент	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045
Игольчатое лезвие	Инструмент	Sharpoint	78-6810
Флуоресцентный микроскоп	Микроскоп	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
Планшет для диссекции	Инструмент	eNasco	SB07840M
Zebrafish (данио-рерио)	Животное	Различные	n/a