В этом видео мы продемонстрируем метод, при котором для анализа развивающихся мозга позвоночных в живых эмбрионов данио на одной резолюции ячейки с помощью конфокальной микроскопии. Это включает в себя метод, посредством которого мы вводим одноклеточного эмбриона полосатого данио, а затем смонтировать и изображение развивающегося мозга.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Живая съемка данио рерио Эмбриональные мозга с помощью конфокальной микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом видео мы продемонстрируем метод нашей лаборатории разработаны для анализа формы клеток изменения и перестановки требуется согнуть и сложить развивающихся данио мозга (Gutzman и др., 2008). Такой анализ дает новое понимание основных клеточной биологии, необходимые для развития 3D-структуры мозга позвоночных, а также значительно увеличивает нашу способность к обучению нейронных морфогенеза трубки. Эмбрионального мозга данио формируется, начиная с 18 часов после оплодотворения (ФВЧ), а желудочки в нейроэпителия надуваться. К 24 HPF, первые шаги нейронных морфогенеза трубки являются полными. Использование метода, описанного здесь, эмбрионов на стадии одной клетки вводят мРНК, кодирующей мембраны ориентированных зеленый флуоресцентный белок (memGFP). После инъекции и инкубации эмбриона, в настоящее время от 18 до 24 HPF, монтируется, перевернутый, в агарозном и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Следует отметить, что данио эмбрион прозрачной что делает его идеальной системой для флуоресцентной визуализации. Хотя наши анализы были направлены на средний мозг, задний мозг границы и задний мозг, этот метод может быть распространен для анализа любой регион данио на глубину 80-100 мкм.
Протокол
1. Подготовка мРНК для инъекций
- МРНК, используемых в этой процедуре расшифрованы с плазмидой, кодирующей CAAX-EGFP (memGFP) мРНК. Первый линеаризовать плазмиды в соответствии с Gutzman и др., 2008.
- Затем записать memGFP мРНК с использованием mMessage mMachine комплект.
- Развести в результате мРНК к 1μg/μl, Алиготе, и хранить при температуре -80 ° C.
- Подготовка литья под давлением в 1% агарозном с полосами шириной эмбрионов на одну ячейку стадии.
- За день до инъекции, созданная спаривания клетки разделяющая мужчин от женщин.
- В день инъекции, потяните капиллярных игл использованием съемника микропипетки подготовить для инъекций.
2. Потребители инъекционных мРНК
- В день инъекции, оттепель аликвоту 1μg/μl memGFP мРНК на льду.
- Развести мРНК 1:5 в воду, чтобы конечная концентрация 200ng/μl, и держать на льду.
- Нагрузка капиллярной иглой с 1 мкл подготовленных мРНК memGFP на 200ng/μl.
- Место загружены иглу в микроманипулятора придается газе microinjector.
- Отрегулируйте объемом впрыска до 1nl.
- Вытяните делителей на диких рыб типа создана в брачный клетки от предыдущего дня.
- Сбор эмбрионов, как только они проложены. Ориентировать их в форме инъекций агарозном покрыта зародыш среды (Уэстерфилд, 1995) с одной клетки на стороне от микроманипулятора.
- Inject через хорион и желток, что мРНК наносится непосредственно в одну ячейку. Inject примерно 50 эмбрионов в эксперименте. Не вводить, если ячейка разделена.
- Инкубируйте эмбрионов при 28 ° С в течение ночи в зачаточном состоянии среды
3. Монтаж и обработка изображений эмбрионов
- Для монтажа и изображения эмбрионов, удалить хориона щипцами из эмбрионов под стереомикроскопа за один час до времени достопримечательность.
- Подготовка слайдов для установки до 4-х эмбрионов.
- Использование силиконовой смазкой для уплотнения вакуумных покровное на нижней специально разработанных 2 мм толщиной пластиковых слайдов с отверстием около 1 см в диаметре.
- Заполните отверстие в слайд с 0,7% агарозы, и дать постоять около 20 минут или до закаленной
- После агарозном укрепил, удалить небольшой плагин использовании 200 мкл наконечники для пипеток формировать цилиндрические отверстия, в которых для монтирования каждого эмбриона.
- Место эмбрионов на агарозном заполненный слайд при вскрытии микроскопом. Добавить 50 мкл tricaine (Уэстерфилд, 1995), чтобы обезболить эмбрионов.
- Используйте пинцет, чтобы положение эмбриона в цилиндрических отверстий в агарозном с мозгом или область интереса от основной покровное.
- Обложка эмбрионов в агарозном с другим покровное обеспеченных смазкой вакуумных силикона.
- Изображение эмбриона использованием перевернутой, люминесцентные, лазерное сканирование или вращающийся диск конфокальной микроскопии. Изображение на 63x или выше, чтобы собирать изображения высокого разрешения отдельных клеток в течение нейроэпителия.
- Изображения экспортируются в виде файлов формата TIFF с LSM программного обеспечения и проанализированы с помощью Photoshop.
4. Представитель Результаты / Результаты
Показанный на рисунке 1 является представителем конфокальной образ 24 HPF данио нейроэпителия между средний мозг и задний мозг желудочков. Каждая ячейка имеет метку с мембраной GFP.
Рисунок 1. Живая конфокальной микроскопии в memGFP впрыском 24 эмбрионов данио HPF.
(А) нейроэпителия из 24 HPF эмбриона с каждой ячейки намеченных GFP. Регион отображаемого отделяет средний мозг и задний мозг желудочков (M, H соответственно), образуя средний мозг, задний мозг границы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом видео мы продемонстрируем метод мРНК инъекции в одно эмбрионов данио клетки. Здесь мы используем мРНК, кодирующей мембраны ориентированных GFP на этикетке каждой ячейке. Затем показано, как монтировать и изображение развивающегося мозга в одной резолюции клетки. Этот метод позволил нам изучить новый тип ячейки меняют форму, базально-перетяжка, необходимых для формирования среднего мозга, заднего мозга границы (Gutzman и др., 2008). Подобный анализ других явлений, есть потенциал, чтобы значительно расширить наше п...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Большое спасибо доктор Дженнифер Gutzman который первым разработал эту технику в Sive лаборатории. Спасибо также JB Зеленый в Dana-Farber института рака Boston, MA который любезно предоставил плазмиды, кодирующей CAAX-GFP мРНК. Конфокальной микроскопии было проведено в WM Keck Фонд фонда изображений Биологические на Уайтхеда. HS поддерживается NIHMH70926. Е. поддерживается NSF предварительно докторских стипендий.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Агароза SeaKem GTG | Реагент | Lonza Inc. | 50027 | |
| Этиловый эфир 3-аминобензойной кислоты (трикаин) | Реагент | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Капиллярная трубка | Инструмент | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Силиконовая вакуумная смазка | Реагент | VWR international | W0S717 | |
| Пинцет | Инструмент | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| Наконечники для пипеток 1-200 μl | Инструмент | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | Данный размер подходит для эмбрионов в возрасте 24 hpf. |
| Набор для транскрипции mMessage mMachine | Реагент | Ambion | AM1340 | РНК-полимераза SP6 |
| Сканирующий конфокальный микроскоп Zeiss LSM 510 | Микроскоп | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Микроманипулятор | Инструмент | Narishige International | ||
| Микроинжектор | Инструмент | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Микропипеточный пуллер | Инструмент | Sutter Instrument Co. |
Ссылки
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
