Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Электрофизиологические Запись в Drosophila Эмбрионов

11K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/1348

⸱

21 мая 2009 г.

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Illinois, 2Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

В этой статье

Краткое содержание

Электрофизиологические записи с Drosophila Эмбрионов позволит анализ развития мышц и нейронов электрическим свойствам, а также характеристика функциональных синаптогенез на глутаматергической нервно-мышечном соединении и центральной холинергической и ГАМК-синапсы.

Аннотация

Drosophilaявляется ведущей генетической моделью для изучения как эмбрионального развития, так и функциональной нейробиологии. Традиционно эти области весьма изолированы друг от друга, имея в значительной степени независимую историю и научные сообщества. Однако интерфейсом между этими обычно разрозненными областями являются программы развития, лежащие в основе приобретения свойств функциональной электрической сигнализации и дифференцировки функциональных химических синапсов на заключительных этапах формирования нейронных цепей. Этот интерфейс представляет собой критически важную область для исследований. ВDrosophilaэти фазы функционального развития происходят в течение периода <8 часов (при 25°C) в течение последней трети эмбриогенеза. Этот поздний период развития долгое время считался недоступным для исследования из-за отложения прочной, непроницаемой эпидермальной кутикулы. Прорывом стало применение гидрополимеризующегося хирургического клея, который можно наносить локально на кутикулу для обеспечения контролируемого препарирования эмбрионов на поздних стадиях. С помощью дорсального продольного разреза эмбрион можно разложить на плоскости, открывая доступ к вентральному нервному шнуру и мускулатуре body wall для экспериментального исследования. Затем могут быть применены методы патч-клампа на всем теле клетки для регистрации активности индивидуально идентифицируемых нейронов и соматических мышц. Эти конфигурации регистрации использовались для отслеживания появления и созревания ионных токов и распространения потенциала действия как в нейронах, так и в мышцах. Были охарактеризованы генетические мутанты, влияющие на эти электрические свойства, чтобы раскрыть молекулярный состав ионных каналов и связанных с ними сигнальных комплексов, а также начать изучение молекулярных механизмов функциональной дифференцировки. Особое внимание уделялось формированию синаптических связей как в центральной нервной системе, так и на периферии. Глутаматергический нервно-мышечный синапс (NMJ) наиболее доступен для сочетания оптической визуализации и электрофизиологической регистрации. Стеклянный всасывающий электрод используется для стимуляции периферического нерва, при этом запись возбуждающего синаптического тока (EJC) проводится в мышце с зафиксированным потенциалом (voltage-clamp). Эта конфигурация регистрации использовалась для картирования функциональной дифференцировки синапса и отслеживания появления и созревания свойств пресинаптического высвобождения глутамата. Кроме того, постсинаптические свойства могут быть изучены независимо путем ионтофоретического или под давлением нанесения глутамата непосредственно на поверхность мышцы для измерения появления и созревания полей глутаматных рецепторов. Таким образом, и пре-, и постсинаптические элементы могут контролироваться раздельно или в сочетании во время эмбрионального синаптогенеза. Эта система активно использовалась для выделения и характеристики генетических мутантов, нарушающих формирование эмбриональных синапсов, что позволило раскрыть молекулярные механизмы, управляющие спецификацией и дифференцировкой синаптических связей и функциональных свойств синаптической сигнализации.

Протокол

Часть 1: Оборудование и расходные материалы

  1. Электрофизиологические записи из эмбрионов дрозофилы в первую очередь требует знания эмбриональных методы вскрытия, которые описаны в другой Юпитер видео.
  2. Электрофизиологические записи из эмбрионов дрозофилы использует стандартные конфигурации зажим патч записи. Патч зажим записывающее оборудование и программное обеспечение для многих других препаратов, также подходит для записи из эмбрионов дрозофилы. Поскольку эмбрионы дрозофилы приклеены к покровным стеклом во время вскрытия, записи камеры должны принять крышка скользит. Толщина подготовку и каким образом оно крепится к покровным требует прямой микроскоп с отличной оптикой и DIC большим рабочим расстоянием объектива.
  3. Два типа ванн решения, используемые для электрофизиологических записи: 1) "стандарт" (Ян и Ян, 1976а) или "изменение стандарта" (Broadie, 2000), солончаков, на основе решения, обычно используемые для записи на других системах беспозвоночных, и 2) "гемолимфы-как" (HL) солончаков (Стюарт и др., 1994), компромисс между стандартной солевой раствор и ионной концентрации измеряются в гемолимфы дрозофилы. Следует отметить, что ни один из этих солончаков точно имитировать ионной концентрации измеряются в гемолимфы, которые являются неблагоприятными для записи (Broadie, 2000). Стандартный солевой содержит (в мм): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 1,8 CaCl2, 72 сахарозы, 5 ТЭС, рН 7,2.

Часть 2: Запись конфигурации

  1. Для физиологических экспериментов, расчлененный эмбриона подготовки помещается в небольшую камеру записи плексигласа (<0,5 мл) и рассматривается в проходящем свете с прямой микроскоп соединения оснащены дифференциальных интерференционного контраста (Номарского) оптики и долгосрочной рабочее расстояние 40-100X ( Обычно 40X) воды погружения цели (Broadie и БАТЭ, 1993a). Записи сделаны, как правило, ниже комнатной температуры (16-22 ° С), с возрастающей сложностью, при повышенной температуре (22 + ° С). Мы добиваемся этого путем охлаждения комнате, а не охлаждение preapartion.
  2. Патч пипеток можно вытянуть из различных волокон заполненные очков (например, боросиликатного стекла, 1 мм внешний диаметр), а также советы должны быть пожарные отполирована до окончательной сопротивление 5-10 Мом. Хлорид-серебряного провода заземления помещается в ванну. Сигналы усиливаются использовании патч-зажим усилителя (например, Axopatch-1D, Axon Instruments), фильтруют с 8-полюсный фильтр Бесселя в 2-10 Гц, и либо пробы он-лайн или хранится в цифровом виде для последующего анализа.
  3. Обычные патч-зажим записи наиболее часто при 18 ° С с накладными пипетки вытащил из древесного волокна, заполненные боросиликатного стекла (полированного советы тепла до ~ 1 мкм ID). Текущие записи сделаны из определены многоядерных мышечных волокон в напряжение-зажим (стандарт проведения потенциалов от -60 до -80 мВ) (Broadie и БАТЭ, 1993-й; Broadie и др., 1997;.. Fergestad и др., 1999; Фезерстоун и др. ., 2000). Решение патч пипетки содержит (в мм): 120 KCl, 20 КОН, 4 2 MgCl, CaCl 0,25 2, 5 EGTA, 4 Na 2 АТФ, 36 Сахароза, и 5 ТЭС, буфер при рН 7,2. Запись электроды резервного заполнены.

Часть 3: Мышцы Запись

  1. В принципе, любой эмбриональных мышц может быть записан с в данном препарате. На практике большинство запись была сосредоточена на больших, вентральных продольных мышц в центральной части наиболее мышечного слоя (БАТЭ, 1990; Broadie и БАТЭ, 1993а-в). Отчеты также были сделаны из спинных и боковых мышц этого мышечного слоя (Kidokoro и Nishikawa, 1994; Auld и др., 1995;. Nishikawa и Kidokoro, 1995;. Баумгартнер в др. 1996). Тем не менее, большинство экспериментов сосредоточиться на группу из четырех продольных, брюшной мышцы (6,7,12,13), особенно в мышцах 6 в передней брюшной полости (А2-А3).
  2. Нет ферментной обработки требуется до мышц записи в молодых эмбрионов (<16 часов AEL). Однако мышцы влагалища развивается в эмбрион позже (> 16 часов AEL) и должны быть удалены с помощью коллагеназы (коллагеназы типа IV, 1 мг / мл в двухвалентных катионов без солевой раствор, 0,5-2 минут при комнатной температуре) до патча записи. После обработки ферментом, печать сопротивления на мышцы, как правило,> 1 ГОм.
  3. Патч-зажим записи могут быть сделаны из эмбриональных мышц с использованием ряда стандартных методов (Broadie и Бейт 1993a-с; Broadie и др., 1994, 1995, 1997;. Nishikawa и Kidokoro, 1995). Любой стандартный патч-зажим вариациях - клеточной прилагается, наизнанку, вне-выход - может быть использован для записи одного канала активности в мышцах или отдельными пятнами мембраны мышцы. Одноместный глютамат рецепторов активности канала (~ 12 мкА при -60 мВ), как правило, наблюдается на фазе падения спонтанных возбуждающих токов перехода (sEJCs), записанные в целом режим клетки.
  4. Большинство Запись производится в цельноклеточной записи конфигурацииuration, легко достигнуто с сотового прикрепленном состоянии с небольшим всасывания или электрического "шума". Мышцы могут быть записаны либо из напряжения зажим (типичный проведения потенциалов от -60 до -80 мВ) или ток-зажим конфигураций. Мышцы у молодых эмбрионов (<13 часов AEL) не может быть эффективно напряжения зажат благодаря обширным связь между эмбриональным myotubes (Broadie и БАТЭ, 1993a), что, как правило, не является проблемой в более поздние (14 + часов AEL) стадиях развития (Уэда и Kidokoro, 1996).
  5. Нистатин-перфорированные патч-зажим запись может быть использована для проверки записей со стандартными цельноклеточная методов (Broadie и БАТЭ, 1993a). Перфорация решение производится следующим образом: 10 мг Pluronic F-127 (Molecular Probes р-1572) растворяют в 20 мл ДМСО, и 10 мг Нистатин растворенного в этом растворе, чтобы сделать запас. 100 мкл акции добавляется 5 мл пипетки раствор фильтруется, чтобы сделать запись решение. Всего-клеточные токи обычно получаются <3 минут после уплотнения образования. Последовательное сопротивление заметно возрастает в большинстве случаев и клетки могут развиваться увеличился ток утечки (Broadie и БАТЭ, 1993a).
  6. Цельноклеточная напряжения закрытого тока в зрелом эмбрионального (и личинок) мышца состоит из пяти видных компонентов (Ву и Haugland, 1985; Zagotta и др., 1988; Broadie и ​​БАТЭ, 1993b).: Внутрь кальция током (I Ca) и четыре внешние токи калия (Tsunoda и Salkoff, 1995), в том числе два быстрых, инактивации токов, напряжения закрытого (Я) и кальций-зависимых (я CF), и два с задержкой, не-инактивации токов, напряжения закрытого (я K) и кальций-зависимых (я CS). Ионно-замены экспериментов могут быть использованы для препарировать этих токов от целой клетки реагирования во время напряжения зажим (Broadie и БАТЭ, 1993b).

Часть 4: нервно-мышечной стимуляции Junction и запись

  1. Наиболее распространенным и надежным методом стимуляции NMJ использует стеклянный электрод всасывание на сегментарные периферического нерва. Всасывающая электроды могут быть выведены из различных волокон заполненные стеклянный электрод (1-1,5 мкм наружный диаметр) и должны быть огневой полировкой для достижения нужной конфигурации (~ 5 мкм, внутренний диаметр). Небольшой сегмент (<50 мкм), соответствующего сегментарного двигательного нерва втягивается в пипетку с нежным всасывания для формирования уплотнения.
  2. Она является общей для стимулирования нетронутыми нервы, рисуя в петле нерва вблизи точки выхода ЦНС. Такой подход позволяет легко стимуляции нетронутыми подготовки, но имеет тот недостаток, что спонтанное CNS-вызванной активности может произойти накладывается на стимулирование прикладных парадигмы. Альтернативой является стимулирование нерва сократить двигателя. Это может быть достигнуто, если ЦНС удаляется, хотя эта процедура имеет тенденцию растягиваться нерв и может привести к повреждениям. Нерва может также быть сокращены с резким микроэлектрода стекла, но эта процедура является трудоемким и сложным. Рекомендуется, что записи быть сделаны из нетронутыми подготовки.
  3. Стимуляция может применяться с различными парадигмами. Краткая стимуляции (0.2-1 мс) работает лучше и интенсивности стимуляции (обычно 1-5 В) будет зависеть от конфигурации и всасывания должна быть экспериментально определяется для каждой ячейки. Сверхпороговой стимуляции двигательного нерва лучше всего достигается путем установки стимул силы чуть выше (+1-2 вольт) порог. Вызванные NMJ ответы записываются с патч-зажаты мышцы, как описано выше. Шок артефакт может быть существенно снизились с использованием изолированной виртуальной земли.
  4. Менее надежную альтернативу стандартной стимуляции нерва электрода всасывания прямой стимуляции центральной нервной системы (Nishikawa и Kidokoro, 1995). Микроэлектрода заполнены 3-4 M KCl (или Каца) вставляется в середину брюшной ганглий и положительных импульсов ~ 2 мкА в интенсивности и ~ 2 мс в срок доставляются (Dietcher и соавт. 1998). Электрода должна быть в ближайшее нейропиля hemisegment где стимуляция лучшего. Синаптической передачи записываются в патч-зажаты мышцы в стандартной конфигурации.
  5. NMJ эмбриональных доступна для цельноклеточной патч-зажим записи на протяжении всей своей дифференциации. Для возбуждающих соединительного ток (ЕЕК) записи, сигналы, записанные с стандартными патч-зажим усилителя, фильтруют (обычно на 1-2 кГц), преобразуется в цифровой сигнал с помощью аналогово-цифровым интерфейсом, а также приобрел с компьютером с помощью соответствующее программное обеспечение.

Часть 5: нервно-мышечном соединении Химическая и лекарствами Приложения

  1. Любая маленькая, заряженные молекулы могут быть эффективно iontophoresed на эмбриональной NMJ (Aravamudan и др., 1999;. Fergestad и др., 1999, 2001). Iontophoretic пипеток можно вытянуть для конкретных конфигураций, с приложениями для различных периодов, с помощью импульсов отрицательной или положительной тока. Очень важно, чтобы предотвратить утечку между пуLSES с соответствующей поддержкой противоположных тока (Broadie др. 1993d;. Фезерстоун и др., 2002, 2005;.. Rohrbough и др. 2007). Величина этой поддержки ток будет меняться в зависимости от конфигурации пипетки и должна быть определена экспериментально.
  2. Многие эксперименты были проведены с NMJ нейромедиатор, L-глутамата (Ян и Ян, 1976b), с использованием 100 мМ маточного раствора (Monosodium соли, рН 8-9) (Broadie и БАТЭ, 1993c). Высокая устойчивость iontophoretic пипетки (100-200 МОм) были использованы для глутамат рецептора (gluR) отображения (Broadie и БАТЭ, 1993d), а также низкое сопротивление пипетки (20-50 МОм) используется для оценки общего ответа gluR (Broadie и соавт. 1995, 1997; Фезерстоун и др., 2002, 2005;. Rohrbough и др. 2007).. Короткие импульсы (0,1-1 мс) отрицательный ток (~ 10 нА) хорошо работают, с небольшой, положительный поддержку текущей, чтобы предотвратить утечку.
  3. Номера для заряженных и заряженные молекулы могут быть применены давление выброса (Fergestad и Broadie, 2001;. Фезерстоун и др. 2001). Для приложений, пипетки давление выброса (<5 мкм внутренний диаметр), содержащий решение расположены близко (<10 мкм) от нервного окончания. Решение для извлечения может применяться с использованием picospritzer (5-10 фунтов на квадратный дюйм) или других источников давлением воздуха (Фезерстоун и соавт., 2002). Во время длительных экспериментов, запись камеры (объем <0,5 мл) должно быть непрерывно перфузии (0,1 - 0,2 мл / сек) с физиологическим раствором ванны.
  4. Многие эксперименты были проведены с гиперосмотического солевой инициировать слияние синаптических пузырьков (Broadie и др., 1995;. Aravamudan и др., 1999;. Fergestad и др., 1999;.. Фезерстоун, и др., 2000, 2002). Другие эксперименты были проведены с токсины, такие как argiotoxin 636 против глутаматных рецепторов и черной вдовой яда паука содержащие latroinsectotoxin (Broadie и соавт. 1995).

Часть 6: Дополнительные нервно-мышечном соединении Vital методов визуализации

  1. Synaptic кинетики пузырька могут контролироваться с люминесцентными липофильных stryl красителей (Fergestad и Broadie, 2001;. Rohrbough и др. 2004). Распределение пузырьков может быть непосредственным наблюдением, а темпы эндоцитоза и экзоцитоза измерить. Несколько вариантов были сделаны с различными флуоресцентными свойствами (FM1-43, флуоресцеином т.п.; FM4-64, родамин-подобных). Модификации оригинального красителя дали продукты с измененными гидрофобными свойствами, и, следовательно, с различной кинетикой вымывания, например, FM2-10 разлагается намного быстрее из мембраны.
  2. Чтобы пометить эмбриональных NMJ с stryl красители, 10 мкМ FM1-43 могут быть загружены в течение 1-5 минут с использованием повышенных внеклеточного калия (50-90 мм) (Fergestad и Broadie, 2001). Более физиологический подход может быть достигнуто с помощью стимуляции электродов всасывания нерва. Препараты затем промывают несколько раз в Са 2 +-свободные буфера в течение 5 минут, и сохранил флуоресценции (представляющие окрашенных синаптических пузырьков) измеряется. Для измерения экзоцитоза, можно выгрузить красителя с использованием либо повышенным калия или электрической стимуляции нерва.
  3. Fusion белков с GFP вариантов были произведены позволяющая многоцветные маркировки эмбриональных NMJ синапса (Brand, 1999;. Чжан и др., 2002). Многие выражения трансгенных GFP с метками белки доступны в том числе общих маркеров мембраны (например, mCD8-GFP), постсинаптические маркеров (например, Шейкер-GFP, GluRIIA-GFP), цитоскелета (например, актин-GFP, moesin-GFP, тубулин-GFP) и митохондриальной маркеров (например, цитохром C-GFP) и синаптических пузырьков маркеров (например, synaptobrevin-GFP, synaptotagmin-GFP;. Чжан и др., 2002).
  4. GFP журналистам этикетке отсеков, которые очень динамичны и могут быть использованы для оценки особенностей развития или мутантных фенотипов (Фезерстоун и Broadie, 2000). Отбеливание, а затем наблюдения восстановление флуоресценции (FRAP) было показано, что осуществимо, по крайней мере на личиночной дрозофилы NMJ (Zhang и др., 2002;. Янь и Broadie, 2007). Слово предостережения, однако: некоторые из этих маркеров не в полной мере спасательных нулевых мутантов и даже может изменить нормальное NMJ физиологии.

Часть 7: Запись из Центральной моторные нейроны

  1. Многие эмбриональных нейронов могут быть индивидуально определены на основе сомы положение и прогноз морфологии (БАТЭ и Мартинес-Ариев, 1993; Гудман и Доу, 1993; Ландграф и др., 1997). Кроме того, система GAL4/UAS (Brand и Perrimon, 1993) могут быть нацелены GFP выражение для визуализации идентифицировать популяции нейронов (Бейнс и соавт., 1998). Запись исследования на сегодняшний день сосредоточено на группе из пяти поверхностным, спинной нейронов в эмбриональном брюшной нервной цепочки (VNC), четыре моторных нейронов (АКК и RP1-4) и один интернейрона PCC (Бейнс и др., 1998, 1999, 2001. ; Rohrbough и Broadie, 2002; Фезерстоун и др. 1995)..
  2. Сотовые органов выявленных нейронов доступны для цельноклеточной патч-зажим электродов записи. Ножны VNC neurolemma сначала должен быть удален с краткими координационного лечение протеазы (Бейнс и БАТЭ, 1998; Бейнс электроннойт др., 1999;. Rohrbough и Broadie, 2002). Спинной тела нейронов подвергаются использованием большого диаметра (~ 20 мкм) патч пипетки содержащие 0,5-1% протеазы (типа XIV (Sigma) в записи физиологический раствор). Материал ЦНС оболочка, запряженной всасывания в пипетки на 1-2 минут, пока оболочка разрывается (Фезерстоун и соавт. 1995). Для подтверждения сотовой идентичности в записи, Люцифер желтый (дикалия соли, 1-2 мг / мл) могут быть добавлены в патч решение для визуализации положения и морфологии клетки.
  3. Стандартный цельноклеточная напряжения и тока-зажим записи могут быть сделаны (Rohrbough и Broadie, 2002;. Фезерстоун и др., 2005). Внешние солевой запись содержит (в мм): 140 NaCl, 3 KCl, CaCl 2 2, 4 MgCl 2, 5 HEPES, 10 сахарозы, 2 NaOH (рН 7,2). Патч раствор содержит (в мм): 140 К-ацетат, 2 MgCl 2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 2 Na 2-АТФ, ~ 6 КОН (рН 7,2). Напряжение-зажим запись производится при проведении потенциалов -60 мВ при 18 ° C. Типичные нескорректированные покоя потенциалы находятся в диапазоне от -45 до -65 мВ (-52,9 ± 7,5 мВ, в среднем ± SD, п = 78).
  4. Доступные тесты показывают напряжения закрытого ионных токов (Бейнс и БАТЭ, 1998), повторяющиеся потенциалов действия, синаптически-опосредованной активности и агонист-закрытого ответов (Бейнс и соавт., 2001). Synaptic вклад в моторные нейроны записывается в форме как быстро AP-опосредованной быстрой возбуждающих синаптических токов (ЭСК), и периодические, устойчивый (до 1 сек продолжительность) эпизоды возбуждающих входных происходит несколько раз или более в минуту (Бейнс и др. ., 1999; Бейнс и др., 2001)..
  5. Сотовые сомы реагировать на iontophoretically применяется ацетилхолина (АХ) и тормозных передатчик ГАМК (Бейнс и БАТЭ, 1998;. Фезерстоун и др. 2005). АЧ может быть применен iontophoretically к сому нейронов через резкое микроэлектрода содержащие 100mM АЧ в дН 2 0, при рН 4-5 в пользу агонист ионофорез положительными тока.

Представитель Результаты

Брюшной продольные мышцы 6 сегментов А2-А3 является наиболее часто использовались мишени для записи (Broadie и БАТЭ, 1993-й, Харрисон и др., 1994;. Суини в др. 1995;. Renden и др., 2001;. Хуанг и др. 2006. Морманн и соавт. 2008). В зрелый зародыш и Новоиспеченный первый взрослой личинки (20-21 часов AEL при 25 ° C = штриховки), мышечные 6 целых емкость ячейки, как правило, 25-30 пФ, а входные сопротивления 20-40 МОм, меняется с развитием возраста. Максимальная NMJ синаптических диапазоне токов от десятков picoamps (13-14 часов AEL) до 1-2NA (20-21 часов AEL), быстро растет в зависимости от возраста. Прямое измерение глутамата закрытого токов максимальная доходность ответы сотен picoamps (13-14 часов AEL) до 1,5-4nA незадолго до вылупления. Последовательное сопротивление ошибки (суммарный ток сопротивления серии X), как правило, <5 мВ, но, в зрелых, предварительно вылупления эмбрионов, может достигать 10 мВ + и, следовательно, компенсация последовательного сопротивления рекомендуется. Эмбриональные мышцы средний диаметр 10-30 мкм, а средняя длина 40-80 мкм, по-видимому, чтобы показать почти идеальных параметров пространства зажимом. Сотовые зажим постоянные времени (R серии XC ячейки) средняя менее 0,25 мс.

В зрелый зародыш и недавно вылупившиеся личинки, спинной населения двигательный нейрон подверглось более ограниченным записи. Нейронные записи сомы раскрыть весь емкость ячейки в диапазоне 1.8-2.5 пФ (2,0 пФ в среднем), последовательное сопротивление 40-60 МОм и входное сопротивление ~ 5 ГОм (Бейнс и БАТЭ, 1998; Фезерстоун и др. 2005). Эти клетки четко увеличиваться в размерах и сложности во время эмбрионального созревания, и этот рост продолжается в течение всего личиночного развития. На третьем возрастов, целые емкость ячейки 17-20 пФ, последовательное сопротивление 25-37 МОм и составляет в среднем входным сопротивлением ~ 900 МОм (Rohrbough и Broadie, 2002, Ричард Бэйнс, личное сообщение). Ионные проводимости увеличения протяжении развития, но плотность тока (пА / пФ) остается на удивление постоянным. В зрелых эмбрионов, синаптические токи среднем 75-100 пА по амплитуде, как с быстрым событий ESC и длительных токов среднем ~ 500 мс (Бейнс и БАТЭ, 1998; Фезерстоун и др. 2005). У эмбрионов, эти события устойчивого среднем 3-5 в минуту, с увеличением до ~ 20 в минуту в первый возраста (Ричард Бэйнс, личное сообщение). Обратите внимание, что морфологическая сложность и свойств мембраны нейронов дрозофилы делает практически невозможным правильно напряжения зажим большую часть ячейки за сомы. Поэтому следует интерпретировать с осторожностью записи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Электрофизиологические записи из эмбрионов дрозофилы требует ручного манипулирования и рассечение. Здоровье подготовки, и, как следствие качество записей, зависит от того, один из которых в состоянии быстро и аккуратно подготовить хрупкой эмбриональных тканей для записи, а затем выполнить эксперимент. Экспериментаторы должны хорошо владеть как эмбриональные вскрытия и электрофизиологии патч зажим, прежде чем пытаться решать одновременно.

Записи можно сделать одним из нескольких вари...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

КБ поддерживается NIH грант GM54544.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Ссылки

  1. Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
  2. Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
  3. Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
  4. Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
  5. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  6. Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
  7. Bate, M., Martinez Arias, A. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Vol. I, II (1993).
  8. Baumgartner, S., JT, L. ittleton, Broadie, K., MA, B. hat, Harbecke, R., JA, L. engyel, Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
  9. AH, B. rand Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  11. Broadie, K. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 273-296 (2000).
  12. Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
  13. Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
  14. Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
  15. Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
  16. Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
  17. Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
  18. Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. eonardo a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
  19. Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
  21. Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
  22. Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
  23. Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
  24. Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
  25. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
  26. Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
  27. Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
  28. Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
  29. Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
  30. Goodman, C. S., Doe, C. Q. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1131-1206 (1993).
  31. Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. vande, Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
  32. Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
  33. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  34. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
  35. Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
  36. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
  37. Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
  38. Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
  39. Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
  40. Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
  41. Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
  42. Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3rd, Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
  43. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
  44. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  45. Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
  46. Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
  47. Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
  48. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
  49. Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
  50. Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
  51. Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP. Genesis. 34, 142-145 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

метод локальной фиксации потенциала на всей клетке (whole-cell patch clamp)нервно-мышечное соединениевентральный нервный шнуррегистрация мышечной активностиаппликация глутаматаприсасывающийся электродклетка ФарадеяLucifer Yellow
Электрофизиологические Запись в Drosophila Эмбрионов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.