Микроинъекция методы для изучения митоза в Дрозофилы Синцитиальный эмбрионов

Краткое содержание

Этот протокол описывает использование микроинъекции и высоким разрешением в Дрозофилы Синцитиального эмбриона для изучения митоза.

Аннотация

Этот протокол описывает использование дрозофилы синцитиального эмбриона для изучения митоза ^1. Дрозофилы имеет полезную генетики с геном последовательность, и ее можно легко сохранять и манипулировать. Многие мутанты митотической существует, и трансгенных мух выражения функциональных флуоресцентно (например, GFP) - меченый белков митотического были и в настоящее время генерируется. Целевые экспрессии генов можно с помощью системы GAL4/UAS ^2.

Дрозофилы раннего эмбриона проводит несколько митозов очень быстро (клеточного цикла продолжительность, ≈ 10 мин). Она хорошо подходит для работы с изображениями митоз, потому что во время циклов 10-13, ядра делятся быстро и синхронно, не вмешиваясь цитокинеза на поверхности эмбриона в одном монослое только под корой. Эти быстро делящихся ядер, вероятно, использовать те же механизмы митотического как и другие клетки, но они оптимизированы для скорости; контрольно-пропускного пункта, как правило, считается не строгим, позволяя изучение митотических белков, отсутствие которых может вызвать остановку клеточного цикла в клетках с сильным контрольно-пропускной пункт . Эмбрионы выражения GFP меченых белков или microinjected с флуоресцентно меченые белки могут быть легко отображаемого следовать жить динамики (рис. 1). Кроме того, эмбрионы могут быть microinjected с функцией блокировки антителами или ингибиторами специфических белков для изучения влияния потери или возмущении их функции ^3. Эти реагенты могут диффундировать по всему эмбриона, достигнув многих шпинделей для получения градиента концентрации ингибитора, который, в свою очередь приводит к градиенту дефектов сравнимы с аллельных серий мутантов. В идеале, если целевой белок флуоресцентно меченных, градиент торможение может быть непосредственно визуализировать ^4. Предполагается, что сильнейшие фенотип можно сравнить с нулевой фенотип, хотя трудно формально исключает возможность того, что антитела могут иметь доминирующую эффектов в редких случаях, так что строгий контроль и осторожная интерпретация должна быть применена. Подальше от укола, функции белка лишь частично потерял позволяющий другие функции белка-мишени, чтобы стать очевидным.

Протокол

Рецепты:

Пластины Виноградный сок:

• 5,5 г Бакто агар
• 14,5 г декстрозы или глюкозы
• 7,15 г сахарозы
• 45 мл концентрата виноградного сока (100% сока).
• 204,5 мл H ₂ 0
• 625 мкл 10N NaOH

Смешайте все ингредиенты и СВЧ до кипения.
Добавить 2,8 мл кислоты смеси (смеси кислот: 20,9 мл пропионовой кислоты, 2,1 мл фосфорной кислоты, 27 мл H ₂ 0)

Смешать и вылить на 35 мм чашки Петри. Давайте затвердевают при комнатной температуре в течение одного или двух дней. Если таблички не будет использоваться в ближайшее время, печать с парафильмом и хранить при температуре 4 ° C (разрешить, чтобы уравновесить до комнатной температуры перед использованием).

Дрожжи пасты:

Растворяют около одной чайной ложки дрожжей (Sigma YSC2, дрожжи Saccharomyces от CEREVISIAE тип II) в воде с образованием густой пасты. Нанесите небольшое количество этого на каждой пластине винограда сок непосредственно перед использованием.

G-PEM буфера:

• 80 мМ Na-ТРУБЫ, рН 6,9
• 1 мМ MgCl ₂
• 1 мМ EGTA
• 1 мМ GTP

Инъекция буфера:

• 150 мМ К-аспартата
• 10 мМ К-фосфатном
• 20 мМ имидазола, рН 7,2

Гептан клея:

Разверните двойной клейкой лентой и поместите в бутылку 100 мл, добавляют 50 мл гептана о, печать бутылку, и рок в течение нескольких дней. При использовании, добавьте гептан, если клей слишком густой.

Обезвоживание камеры:

Возьмите 100 мм чашки Петри, положите одну часть 35 мм блюдо внутри, чтобы сделать "стол" и добавить Drierite (безводный сульфат кальция) вокруг него так, чтобы высота Drierite не выше, чем "стол" и крышкой. Покровное с эмбрионами будут размещены на этом "стол" для обезвоживания перед инъекцией. Это хорошая идея использовать по крайней мере некоторые указали, Drierite и изменить его, когда он изменил цвет.

Протокол:

Этот протокол может быть использован для инъекций практически любой растворимый реагента в дрозофилы синцитиального эмбриона: Например, как флуоресцентный белок для наблюдения или ингибитором белка-мишени или обоих.

Получение все готово:

1 .- 2 до 3 дней до начала эксперимента, сделать виноградный сок пластин и настроить лежала клетке: Возьмите пластиковую бутылку (6 унций с круглым дном из прикладных научных дрозофилы), вырезать два маленьких отверстия (около 1 см ²⁾ на противоположных сторонах бутылку и залейте хлопка кусок (это позволит воздуху поток), нажмите мух в бутылку и залить виноградным соком пластины. Хранить при температуре 25 ° С (или при комнатной температуре), мухи должны заложить эмбрионов в течение приблизительно 10 дней.

2 .- По крайней мере, за один день до эксперимента вытащить иглы для инъекций, мы используем иглы Kopf / Внесите съемник модели 720 и тонкостенных стеклянных нитей (Всемирный точных приборов tw100f). Для инъекций флуоресцентных тубулина, держите иглы при 4 ° С, чтобы предотвратить температуры индуцированной полимеризации в иглу.

Тубулина подготовки:

Примечание: Все работы с тубулина должно быть сделано при 4 ° С для предотвращения полимеризации.

1. Возьмите помечены тубулина из холодильника и положить его на льду в течение 5 до 15 минут.
2. Разбавить G-буфера PEM (от 4 до 10 раз в зависимости от интенсивности требуется).
3. Центрифуга на 13k оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 10-15 минут.
4. Нагрузка 1 - 2 мкл в иглу.

Антитела или химического ингибитора:

Подготовка иглы также для тубулина, с использованием соответствующей концентрации (это возможно, должны быть проверены). Антитело может быть в инъекции буфера, G-буфера или PEM PBS. Если другой буфер нужен, этот буфер должны быть введены в качестве контроля, чтобы убедиться, этот буфер не вызывает никаких повреждений сам по себе.

Примечание: Ингибитор и флуоресцентные тубулина могут быть смешаны и вводят вместе, если концентрация позволяет. В противном случае, вводить флуоресцентные тубулина и ждать от 5 до 10 минут перед инъекцией ингибитора. При выполнении двойного впрыска, начните с более эмбрионов, так как меньше эмбрионов будет восстанавливаться в обычном режиме.

Эмбрион коллекции:

1. Положите новой пластинкой виноградного сока на клетке лежала.
2. Удалить эту пластину через час, это первый сборник день и часто не очень хорошо. Она может быть отброшена.
3. Изменение пластины каждый час, чтобы держать сбора эмбрионов в течение одного часа каждый.

Покровное подготовки:

1. Положите 50 х 22 мм покровным с одной стороны стекло микроскопа. Лента четырех углах на слайд, чтобы он не двигаться.
2. Использование хлопка наконечником аппликатором, положить в один слой клея гептана в одну линию на покровное (клей не должен быть вязким и должен сохнуть в течение нескольких секунд, в противном случае добавить еще гептана).
3. Положите кусокдвойной липкой лентой на сползание к стороне покровного стекла.

Эмбрион подготовки:

Примечание: Эмбрионы должны быть отображены около 2 часов после начала сбора, чтобы начать следующие шаги обеспечивают достаточное время, чтобы закончить их в течение этого периода времени.

1. С смоченной кистью тщательно подобрать эмбрионов от пластины виноградным соком и положите на двойной липкой лентой на слайде.
2. Использование внешней части пинцет, рулон эмбрионов над двойной липкой ленты, пока хориона (наружной мембраны) разрывается.
3. Возьмите эмбриона, осторожно прокатки его над хориона так он прилипает к пинцет и поместите его на гептан клея на покровное с длинной стороне эмбриона параллельно длинной стороне покровного стекла. Настройка от 10 до 20 эмбрионов в одном ряду.
4. Удалить покровное и поместить его в камеру для обезвоживания 3 до 8 минут (это зависит от влажности помещения и суммы, который будет введен).
5. Место на металлической камеры с вакуумной смазкой.
6. Обложка эмбрионов с галоидоуглеводородов 700 масла, чтобы избежать дальнейшего обезвоживания. Эмбрионы теперь готовы для инъекций.

Эмбрион инъекций:

1. Найти эмбрионов под 16x цели.
2. Перемещение эмбрионов далеко, и найти иголку без перемещения фокальной плоскости.
3. Центр иглы и переместить его вверх, не двигая его в х или у.
4. Если игла не открыто, положить край покровного в поле зрения, но не там, где игла будет, а нижняя игла же фокальной плоскости. Очень осторожно двигаться покровное, пока не встретит иглы и аккуратно разбивает его открытым. Если игла открытым, переходите к шагу 5. (Иглы можно открыть с помощью плавиковой кислоты до заполнения).
5. Положите эмбрионов с учетом (но не там, где игла будет), снижение иглу в нефти и убедитесь, что вы получите хорошие капли жидкости из иглы.
6. Осторожно, но уверенно двигаться эмбрион в иглу и вводят каплю в эмбрионе и двигаться эмбриона прочь. (Или следуйте инструкциям вашего инъекции аппарат).
7. В конце концов эмбрионы были введены, они готовы для наблюдения по конфокальной микроскопии.

Получение изображений:

Изображения эмбрионов на конфокальной микроскопии с 60 или 100X цель:
Примечания:

1. Отрезка времени, на серии промежуток времени должно быть не более нескольких секунд, так как митоз в эмбрион очень быстро, в зависимости от конкретного процесса, который будет изучен.
2. 3D-серии или одной плоскости может быть приобретено в зависимости от процесса, представляющих интерес.
3. Для быстрого действия ингибиторов, переход от инъекций микроскоп для визуализации микроскопа должно быть быстрым.

Рисунок 1: Изучение митоза у дрозофилы синцитиального эмбриона. Ядер в раннем эмбрионе претерпевают быстрое подразделений без цитокинеза, во время циклов с 10 по 13 ядер форме монослоя в коре головного мозга.. Схема раннего эмбриона с ядрами при коры головного мозга. Эмбрион может выразить GFP и / или RFP меченых белков и может быть microinjected с другими меченых белков и / или ингибиторов. Б. Временной интервал изображения эмбрионов выражения GFP-тубулина и RFP-гистонов. С. земельный полюс-полюс разделения циклов 11 , 12 и 13 в дикой эмбриона типа. Длина шпинделя экспонатов периодов изометрических длины и периоды относительного удлинения, которые очень последовательным и воспроизводимым. Д. Динамика микротрубочек веретена. Введение низких концентрациях родамина тубулина приводит к крапинками формируется из нескольких субъединиц тубулина, которые могут быть использованы для изучения динамики микротрубочек.

Обсуждение

Этот протокол является относительно простым, тем не менее, каждый шаг требует практики, чтобы убедиться, эмбрионы не повреждены. Тщательные контрольные эксперименты всегда нужно сделать для того, что надежные результаты получаются. Один хороший способ начать это путем microinjecting буфера или родамин тубулина в контрольных эмбрионов выражения GFP-тубулина, чтобы убедиться, что митоз протекает нормально через все циклы на поверхности эмбриона (циклов с 10 по 13). В контрольных эмбрионов вы не должны заметить каких-либо ...