Multi-купе ЦНС Нейрон-глии сотрудничеству культуры микрожидкостных платформы

Краткое содержание

Мы разработали новый несколькими отделениями нейрона со-культуры микросистемы платформу для экстракорпорального ЦНС Аксон-глии взаимодействия исследования. Платформа способна проводить до шести независимых экспериментов параллельно и изготовлены с использованием недавно разработанных макро / микро гибридный метод изготовления.

Аннотация

Мы представляем новую многокамерную микросистемную платформу для совместного культивирования нейронов, предназначенную для исследования взаимодействий аксонов и глии ЦНС in vitro, которая позволяет проводить до шести независимых экспериментов параллельно для увеличения пропускной способности. Нами был разработан новый метод изготовления микрофлюидных устройств, содержащих структуры как микро-, так и макромасштаба в одном изделии, с использованием одного процесса мягкой литографии, что обеспечивает возможность массового производства с хорошей воспроизводимостью.

Многокамерная микрофлюидная платформа для совместного культивирования состоит из одной камеры для тел нейронов (сомы) и шести камер для аксонов и глии, предназначенных для олигодендроцитов (OLs). Камера для тел нейронов и камеры для аксонов/глии соединены массивами направляющих аксоны микроканалов, которые служат физическими барьерами, удерживающими тела нейронов в соответствующей камере и одновременно позволяющими аксонам прорастать в камеры для аксонов/глии. Олигодендроциты, помещенные в камеры для аксонов/глии, могут взаимодействовать только с аксонами, но не с телами нейронов или дендритами, что позволяет проводить исследования локализованного взаимодействия аксонов и глии. Микроканалы также обеспечивают гидродинамическую изоляцию между камерами, что позволяет проводить шесть независимых экспериментов на одном устройстве для повышения производительности.

Мягкая литография с использованием поли(диметилсилоксана) (PDMS) является широко применяемым методом при создании биомедицинских микроустройств. Резервуары в таких устройствах обычно формируют путем ручного пробивания. Несмотря на простоту, плохая точность совмещения и трудоемкость делают этот процесс непригодным для случаев, когда требуется многократно создавать большое количество резервуаров. Разработанный новый метод не требует ручного пробивания резервуаров, что позволяет преодолеть данные ограничения. Сначала с помощью станка с микрофрезерованием в блоке из поли(метилметакрилата) (PMMA) были созданы семь резервуаров (глубиной 3.5 mm). Затем массивы микроструктур в виде гребней, изготовленные на стеклянной подложке, были подвергнуты горячему тиснению на блок PMMA для формирования микроканалов, соединяющих компартменты сомы и аксона/глии. В результате этого процесса макромасштабные резервуары (3.5 mm) и микромасштабные каналы (2.5 μm) были совмещены в единой мастер-форме из PMMA. С помощью мягкой литографии была получена реплика из PDMS, которая служила основной формой, и на ее основе было изготовлено конечное устройство из PDMS.

Первичные нейроны крыс E16-18 помещали в соматический отдел и культивировали в течение двух недель. Через одну неделю культивирования аксоны пересекли микроканалы и сформировали слой сети, состоящий только из аксонов, внутри отделов для аксонов/глии. Аксоны равномерно росли во всех шести отделах для аксонов/глии, и на 14-й день in vitro в отделы для аксонов/глии добавляли олигодендроциты крыс P1-2 для создания совместной культуры.

Протокол

Часть 1: Подготовка мастер формы с несколькими отделениями нейрона со-культура изготовления устройства

1. Первый шаг для изготовления ПММА мастера, чтобы сделать 3,5 мм в глубину отсеков. Одно отделение сомы и шесть аксон / глии отсеков определяются на блоке ПММА использованием микро-фрезерный станок (MDX-40, Roland или любой другой фрезерный станок с ЧПУ). ПММА мастер затем обрабатывали ультразвуком в изопропилового спирта в течение 10 минут, чтобы удалить мусор.
2. Массивы 2,5 мкм высоких структур гряды по образцу 50,8 мм х 50,8 мм стекло от стандартного процесса фотолитографии с последующим травлением мокрого стекла.
   Во-первых, массив хребта структуры по образцу очищены стеклянную подложку с положительными фоторезиста S1818 использованием фотолитографии. S1818 является спин-покрытие на подложке (4000 оборотов в минуту), мягкие основан при 110 ° С в течение 5 мин, а затем под воздействием УФ света (84 мДж / см ²⁾ с помощью маски Aligner последующим развитием фоторезиста в MF319 в течение 40 секунд. Затем стекло фоторезиста узорной подложкой погружается в буфер оксида травления (BOE) при комнатной температуре в течение 6-7 минуты, чтобы получить 2,5 мкм высоких структур хребта. Наконец, слой фоторезиста удаляют ацетон, изопропиловый спирт, после тщательного промывания в деионизованной (DI) воде.
3. Стеклянную подложку с микро-гребень структур горячего тиснения с мастером ПММА передавать свои узоры.
   Во-первых, ПММА мастер формы и стеклянные подложки вручную выравнивается и помещен на горячую прессы. Затем, при повышении температуры до 115 ° C. Как только желаемая температура будет достигнута, 0,5 тонны веса применяется в течение 5 минут. Через 5 минут, температура охлаждается до 40 ° С и давление не будет отпущена. Мастер ПММА затем разрезается на 50,8 мм х 50,8 мм размер блока.
4. PDMS предварительно полимера (Sylgard 184) смешивается с отвердителем в соотношении 10: 1 по массе.
5. ПММА мастер находится внутри бочки и PDMS смесь выливают на вершине ПММА мастер для изготовления мастер PDMS. Он помещается в эксикатор связано с вакуумным насосом. PDMS вылил на вершине ПММА мастер затем дегазируют в течение 15 мин для удаления пузырьков, образующихся при PDMS процесса перемешивания.
6. Когда все пузырьки удаляются, PDMS помещают в печь выровняли 85 ° C в течение одного часа для полимеризации.
7. После PDMS полностью вылечить, PDMS мастера снимают из ПММА мастера и помещен эксикаторе с 2-3 каплями трихлорсилана и пылесосом в течение 15 минут, чтобы пар покрыть поверхность PDMS мастера. Трихлорсилана покрытие облегчает выпуск окончательного PDMS нейрона со-культуры устройств от мастера PDMS. После нанесения покрытия, PDMS мастер кратко промыть изопропиловый спирт для удаления чрезмерного трихлорсилана и сушат с N ₂ газа.

Часть 2: Нейрон культуры устройства репликации

1. PDMS предварительно полимера (Sylgard 184) смешивается с отвердителем в соотношении 10: 1 по массе.
2. PDMS смесь выливают на вершине PDMS мастера и дегазированной в эксикаторе связаны с вакуумным насосом в течение 15 минут. Важно не влить слишком много PDMS, так что 3,5 мм структуру PDMS на мастер не полностью погружены в воду.
3. Когда все пузырьки удаляются, PDMS помещают в печь выровняли 85 ° C в течение одного часа для полимеризации.
4. PDMS вынимается из печи после одного часа и оставляют при комнатной температуре, чтобы остыть. Затем, PDMS устройств нейрона культуры осторожно снимают с мастером PDMS. Очищенные от PDMS устройства обматывают парафильмом чтобы защитить их от пыли и мусора.
5. PDMS устройств, завернутый с парафильмом, разрезать на отдельные части, используя сверлильный станок оснащен лезвием.

Часть 3: Устройство сборки

1. PDMS нейрона культуры устройство помещается внутри плазмы чистым и подвергаться воздушной плазмы в течение 90 секунд, чтобы сделать поверхность устройства PDMS гидрофильными. Это лечение плазмы будет способствовать микроканалов быть заполнен питательной среды после сборки поли-D-лизин покрытием подложки.
2. Устройства получавших плазмы затем погружали в 70% этаноле в течение 30 минут для стерилизации и переехал в стерилизованной био-капюшон.
3. Стерилизованное устройства вывезены из 70% этанола и сушат Millipore фильтруется N ₂ газа. Сушеные устройства размещены в верхней части поли-D-лизин покрытием полистирола 6-луночный планшет культуры и мягкое давление применяется для обеспечения уплотнения между подложкой и устройства.
4. Культура СМИ и заполнения в отсек сомы, а затем, заполнив шесть аксон / глии отсеков. Лучше дать 1-2 минут паузы перед заполнением аксон / глии отсеков после добавления питательных сред в купе сомы обеспечить, чтобы ни пузырьков внутри микроканалов.
5. Устройства заполнены питательных сред, инкубируют в 37 ° С инкубатор ночь полоскать любые возможные мусора или токсичных остатков.

Часть 4: Загрузка клеток и нейронов-олигодендроцитов совместно культуры

1. В первый день из культуры клеток, первичных нейронов переднего мозга клетки из эмбриональных день 16-18 крыс загружается в отсек сомы в плотности записи в 500 клеток / мм ^2. Во-первых, питательные среды внутри и отсек сомы и аксонов / глии отсеки атмосферный использованием пипетки до ячейку нагрузкой. Затем, 38500 клеток, разводят в 40 мкл культуральной среды, загружаются в соме отсеке вокруг микроканальных заливов. Важно не касаться устройства PDMS при загрузке клеток, так как она может нарушить уплотнение между устройством и подложки.
2. Инкубируйте ячейка загружается устройства в течение 30 минут в 37 ° С инкубатор для повышения адгезии клеток к субстрату. После инкубации все отсеки заполняются питательных сред.
3. Клетки культивировали при 37 ° С в увлажненной 5% СО ₂ инкубатора и только половина из питательных сред меняется каждые 3-4 дня.
4. После 14 дней нейрона культуры в пробирке, олигодендроциты добавляются к аксону / глии отсеков для совместного культуры. Олигодендроцитов, рассеченные из полушарий Sprague-Dawley крыс в постнатальный день 1-2, добавляются каждый аксон / глии отсеке области плотностью 1000 клеток / мм ^2. Перед загрузкой клеток, примерно 60% медиа-культуры внутри отсеков атмосферный с пипеткой. Предупреждение должно быть сделано не касаться нижней подложки, так как это может повредить аксонального сети формируется на подложке. Затем, 6700 олигодендроцитов клеток, разведенного в 5 мкл культуральной среды, будут добавлены в аксон / глии отсеков. Клетки инкубировали в течение 1 часа и отсеки заполняются питательных сред.
5. Клетки культивировали при 37 ° С в увлажненной 5% СО ₂ инкубатора и только половина из питательных сред меняется каждые 3-4 дня в течение еще ​​двух недель.

Часть 5: Представитель Результаты:

Когда эксперименты проводились должным образом, нейронные клетки загружены в купе сомы найти близкие к микроканальных заливов и аксонального слоя начинают формироваться внутри аксона / глии отсеков через 1 неделю культуры. Знак нейрона агрегации клеток внутри отсека сома может быть признаком того, что клетки не здоровы. При загрузке олигодендроциты после двух недель культуры нейронов, аксонов / глии отделения должны быть покрыты плотным слоем аксонов и олигодендроциты должны быть загружены на вершине аксонального слоя.

Рисунок 1. Схема иллюстрации высокой пропускной микрожидкостных несколькими отделениями ЦНС нейронные совместно культуры платформы. Поперечное сечение показывает изоляцию аксоны нейронов из сомы и дендритов, а также жидкостных изоляцию между отсеками с минуту жидкостный уровень разницы. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.

Рисунок 2. Изготовление и монтаж шаги для нескольких отсеков PDMS микрожидкостных совместно культуры устройства. Каждое устройство помещается в одну лунку обычные 6-и полистирола пластины культуре клеток. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.

Обсуждение

Мы разработали с несколькими отделениями совместно культуры платформу для изучения млекопитающих ЦНС Аксон-глии взаимодействия. ЦНС аксонов были успешно изолированы от нервных клеток органов / дендритов и олигодендроцитов были успешно со-культурный внутри устройства. Нейрон плотности можно варьировать, приложений, но слишком низкой или слишком высокой концентрации может вызвать отмирание клеток. Кроме того, важно изменить только половина медиа-культуры так, чтобы клетки или аксонального слой на подложке, не повреждены. ...