Методическая статья

Количественная оценка Дрожжи Lipidome использованием Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

DOI:

10.3791/1513

⸱

21 августа 2009 г.

 , 
1Department of Biology, Concordia University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем новый количественный метод lipidomics для выявления многочисленных видов липидов в дрожжах использованием обследований сканирования электрораспылением ионизации масс-спектрометрии (ESI / MS). Этот метод в настоящее время превышает методов идентификации и количественного определения липидного в способности для решения самых разных молекулярных форм липидов, чувствительность и скорость.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липиды являются одним из основных классов биомолекул и играют важную роль мембраны динамика, накопление энергии, и сигнализация

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Материалы и методы

  1. Штаммов дрожжей и условий роста
    Штамма дикого типа BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) был выращен в богатой среде YEPD (1% дрожжевой экстракт, пептон 2%, 2% глюкозы). Клетки культивировали при 30 ° С с вращательными встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в колбах Эрленмейера на "колбе объем / средний объем" отношением 5:1.
  2. Хранение дрожжевых клеток для экстракции липидов
    1. 50 мл культуры клеток собирают центрифугированием при 3000 мкг в течение 5 минут.
    2. Промывают два раза с холодной водой.
      1. Ресуспендируют гранул в 25 мл ледяной воды
      2. Гранул клеток в центрифуге при 3000 мкг в течение 5 минут
    3. Ресуспендируют гранул и трансфер в Эппендорф трубки
    4. Гранул путем центрифугирования, 16 000 мкг в течение 2 минут, удалите супернатант и заморозить при -80 ° C до использования. (Мы используем стакан изопропиловый спирт хранится в морозильной камере -80, жидкий азот также может быть использован)
  3. Реагенты
    Biotech класса хлороформа и метанола от Sigma-Aldrich. Свободные жирные кислоты и триглицериды были приобретены у Larodan (Мальме, Швеция). Различные виды фосфолипидов - в том числе фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерина, фосфатидная кислоты и cardiolipins - были получены из Avanti Полярный липидов (Alabaster, Алабама, США). Высокоскоростной стекла пробирок с тефлоновым выстроились шапки из Фишер.

Липидный добычи

Это изменение протокола описывается Блая и ​​Дайера 8. Все манипуляции с извлекаемыми липидов должно быть сделано с помощью стеклянной пипетки или шприцы; пластмасс создаст большие фонового сигнала, если они вступают в контакт с хлороформом. Точные объемы не являются критическими тех пор, пока отношения 1:2:0.8 для хлороформ - метанол - H 2 O на шаге 3 и 2:2:1.8 для хлороформ - метанол - H 2 O в шаге 7 сохраняются.

  1. Ресуспендируют замороженных клеток в 1,6 мл ледяной дистиллированной H 2 O.
  2. Передача 1,6 мл клеточной суспензии к высокоскоростному стеклянные трубки центрифуги.
  3. Добавить 6 мл хлороформа и метанола (1:2) смеси и 0,8 мл стеклянных шариков для клеточной суспензии.
  4. Vortex клеточной суспензии со стеклянными шариками два раза в течение 1 мин.
  5. Добавьте 2 мл хлороформа и аккуратно перемешать.
  6. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре с редкими смешивания.
  7. Добавьте 2 мл дистиллированной H 2 O и аккуратно перемешать.
  8. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре с редкими смешивания.
  9. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  10. Сбор всей жидкой фазы в новой высокоскоростной центрифуге трубки стекла.
  11. Добавить 3,2 мл хлороформа в камеру гранулы из шагу 9.
  12. Vortex два раза в течение 1 мин.
  13. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  14. Добавить супернатант в жидкую фазу, начиная с шага 10.
  15. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  16. Откажитесь от верхней (водный) фазы и передачу ниже (органические) фазы в новой высокоскоростной центрифуге трубки стекла.
  17. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  18. Передача всей супернатант в стеклянный флакон и сухой атмосфере азота.
  19. Растворите липидной пленки в 500 мкл хлороформа и хранить при температуре -20 ° C.

Анализ липидов методом масс-спектрометрии

Акции смесь липидных стандартов в хлороформе должны быть подготовлены заранее, так как в таблице 1, а также исходный раствор метанола - хлороформ (1:1) с 0,1% (об. / об) гидроксида аммония.

  1. До инъекции, объединить 10 мкл образца 10 мкл стандартной смеси липидов представлены в таблице 1. В 200 мкл 1:1, хлороформ: метанол с 0,1% NH 4 OH.
    • Стандарт образца соотношение может быть изменен по мере необходимости.
  2. Решение липидов использованием Micromass Q-TOF масс-спектрометр 2 оснащены нано-электрораспылением источник, работающих на скорости потока 1 мкл / мин.
    • Точные параметры инструмента будет варьироваться от инструмента к инструменту. См. Таблицу 2 для параметров Micromass Q-ToF 2 (Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США), оснащенных нано-электрораспылением источник. Хотя мы и воспользовались высоким разрешением Q-TOF тип масс-спектрометра, это не обязательное требование.
  3. После приобретения масс-спектрах сглаживаются, фон вычитается и по центру, а затем пик список экспортируется в Excel. Пиков каждого липидного класса, то нормализованные к их внутренним стандартам. В зависимости от приложения, оно может быть необходимо делать выполнения дальнейшей пост-обработки, такие как deisotoping и деконволюции.

Таблица 1. Внутренние стандарты липидов, их концентрация встандартные смеси, а режим MS для их анализа.

Липидный класса Стандартный состав цепи Масса стандартной Концентрация (мкг / мл) MS режиме
Фосфатидных кислоты 14:0 / 14:0 591,40 100 Отрицательный
Фосфатидилэтаноламина 14:0 / 14:0 634,45 200 Отрицательный
Фосфатидилинозитол N / A N / A N / A Отрицательный
Фосфатидилсерин 14:0 / 14:0 622,37 40 Отрицательный
Кардиолипин 4x14: 0 619,92 100 Отрицательный
Свободные жирные кислоты 19:00 297,28 100 Отрицательный
Фосфатидилхолин 14:0 / 14:0 650,48 100 Положительный
Триглицериды 13:0 / 13:0 / 13:0 698,63 200 Положительный

Таблица 2. Инструмент настройки для Micromass Q-ToF 2 (Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США), оснащенных нано-электрораспылением источник.

Расход Конус напряжения Капиллярная напряжения Столкновение газа
Положительные режиме 1μl/min -28 V 3,0 кВ 10
Отрицательные режиме 1μl/min 30 В -3,2 КВ 10

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод позволяет быстрое количественной оценки дрожжей lipidome с помощью легко доступных, недорогих материалов. Метод позволяет идентифицировать большинство из липидных видов, обитающих в дрожжевые клетки, за исключением diacylglycerols, ergosterols и ergosteryl эфиры, хотя эти липиды могут быть идентифицированы по замене гидроксида аммония с гидроксидом лития. Описанный метод позволяет идентифицировать липидов и количественная на таких низких концентрациях, как мкг / мл, с концентрацией линейности распространяется...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Ален Tessier за ценные советы, обсуждения и техническую поддержку. Мы признаем, центр биологических Применение масс-спектрометрии в Конкордии университета за выдающиеся заслуги. Эта работа была поддержана грантами CIHR и NSERC Канады. VIT является следователь CIHR Новые и Concordia University исследований кафедры геномики, клеточной биологии и старения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
  2. Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
  3. Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
  4. Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
  5. Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
  6. Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
  7. Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
  8. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Saccharomyces cerevisiaeQ TOF

Похожие статьи