Эндотелиальная колониеобразующих клеток-предшественников (ECFCs) являются перспективным инструментом для изучения сосудистого гомеостаза и ремонта. 1,2 В работе вводится новый животного сыворотки метод выделения и расширения ECFC с гепарином взрослых периферической крови человека с объединенные тромбоцитов человека лизат (pHPL) уменьшение риска против бычьего иммунизации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и расширение добычи взрослых человеческих эндотелиальных клеток, образующих колонии Прародитель
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В данной статье представлена новая стратегия восстановления эндотелия колониеобразующих клеток-предшественников (ECFCs) с гепарином, но в остальном unmanipulated взрослого человека периферической крови в среднем 12 дней. После большого расширения масштабов> 1x10 8 ECFCs могут быть получены для дальнейших испытаний. Преимущественно с помощью pHPL контакта клеток человека с бычьей сыворотки антигены могут быть исключены. По проточной цитометрии и иммуногистохимии изолированных клеток можно охарактеризовать как ECFC и их функциональность в пробирке для формирования сосудистого подобных структур может быть протестирована в анализе Матригель. В дальнейшем эти клетки могут быть подкожно вводили в модель мыши для формирования функциональной, перфузии судов в естественных условиях. После долгосрочного расширения и распространения криоконсервации, функции и геномной стабильности по всей видимости, сохранится. 3,4
Это животное-белковые свободной изоляции и расширения метод легко применимы для создания большого количества ECFCs.
Протокол
А.) ECFC ISOLATON
ДЕНЬ 1:
- Перед тем, как начать с эксперимента подготовить среду клеточной культуры среднего роста эндотелия-2 (EGM-2). Дополнение 500мл эндотелиальной базальной среды-2 с гепарином (1 мл 1000 ЕД / мл), 5 мл 100x раствор пенициллина / стрептомицина (все Sigma, Сент-Луис, штат Миссури; www.sigmaaldrich.com ), L-глютамин (2 мМ конечной концентрации ), и 50 мл объединенных человека лизат тромбоцитов (pHPL). Затем добавить 0,2 мл гидрокортизона, 2 мл hFGF-B, 0,5 мл VEGF, 0,5 мл EGF, 0,5 мл IGF-1 и 0,5 мл аскорбиновой кислоты (при условии, как SingleQuots, все Lonza, Уолкерсвил....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эта изоляция романа и расширение метод простой и эффективный процесс, который является более эффективным и менее затратным по времени, избегая любой ячейке разделения (без градиента плотности необходимости) и дешевле, чем традиционные методы. При использовании pHPL контакт с бычьей антигенов и предполагаемых последующих xenoimmunization исключается. Во время периода культивирования небольшие сгустки могут образовываться, вызванные pHPL. Основываясь на нашем опыте эти сгустки не влияют на формирование колонии и пролифера.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Авторы благодарят доктора Катарина Schallmoser за предоставление pHPL и Маргарета Frühwirth и Даниэла Талер за отличную техническую помощь.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Базосреда для эндотелиальных клеток Endothelial basal Medium-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| Добавки EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, гидрокортизон, аскорбиновая кислота | |
| Гепарин без консервантов | Biochrom AG | 10U/ml на EGM-2 | |
| L-глутамин | Sigma-Aldrich | 2mM на EGM-2 | |
| Пенициллин и стрептомицин | Sigma-Aldrich | 100U/mL пенициллина и 100μg/mL стрептомицина на EGM-2 | |
| Трипсин/1mM EDTA | Invitrogen | 7ml для флакона T75 70ml для CF-4 | |
| PBS | |||
| Четырехслойная клеточная фабрика (CF-4) | Corning | ||
| Стерильная воронка | Corning | ||
| Культуральный флакон T75cm2 (с вентилируемой крышкой) | Corning | ||
| Вакутейнеры объемом 6 mL (с натрия гепарином без консервантов) | BD Biosciences | предварительно заполненные 108 IU/6ml натрия гепарина без консервантов | |
| Пробирки Falcon объемом 50ml | Falcon BD | ||
| Дозаторы Stripetts объемом 5ml | Costar | ||
| Дозаторы Stripetts объемом 25ml | Costar | ||
| Сквизер (выжиматель) | Costar | ||
| Стерильный фильтр с размером пор 0,2 | EMD Millipore | 2x 500ml на EGM-2 |
Ссылки
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells vi....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
