Данио верхнечелюстной усач является покровный орган чувств содержащие эктодермы, мезодермы и нервной производных гребня. Важно отметить, что взрослый усач может регенерировать после проксимальной ампутации. Это видео знакомит верхнечелюстной развития усач и демонстрирует, хирургический протокол, чтобы вызвать регенерацию, а затем сбор, вложение и вниз по течению изображений образцов усач.
Методическая статья
Методы изучения данио рерио Верхнечелюстная Барбель
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Усики являются придатками кожи сенсорных обнаружили у рыб, пресмыкающихся и земноводных. Данио рерио, данио rerio, разрабатывает две пары усиков-короткие носовые пары и больше верхнечелюстной пары. Усик ткань содержит клетки эктодермы, мезодермы и нервной происхождения гребень, в том числе клеток кожи, желез, вкусовые рецепторы, меланоциты, кровообращения сосудов и нервных окончаний. В отличие от большинства взрослых тканей, верхнечелюстной усач является оптически ясно, что позволяет нам представить себе развитие и поддержание этих типов тканей на протяжении всего жизненного цикла.
Это видео показывает раннее развитие верхнечелюстных усач (начиная примерно через месяц после оплодотворения) и демонстрирует, хирургический протокол, чтобы вызвать регенерацию в придаток взрослых (> 3 месяцев после оплодотворения). Короче говоря, левой верхнечелюстной усач из наркоза рыбу повышенным стерильным пинцетом только дистальнее хвостового края верхней челюсти. Штрафа, стерильными ножницами весной позиционируется против щипцы, чтобы сократить вал усача на этом уровне, создание анатомических ориентиром для ампутации плоскости. Регенеративной роста могут быть измерены по отношению к этой плоскости, и по сравнению с контралатеральной усач. Усик ткань восстанавливается быстро, достигая максимального отрастания течение 2 недель после травмы.
Методы анализа регенерированного усач включают рассечение и вложение соответствует пары усиков (регенерации и контроля) в лунки стандартный гель-электрофореза ДНК. Встроенные образцов удобно фотографироваться под стереомикроскопа за грубые морфологии и морфометрии, и могут храниться в течение недели до вниз по течению приложения, такие как парафин гистологии, cryosectioning, и / или целые иммуногистохимии монтирования. Эти методы создания верхнечелюстной усач, как роман, в естественных условиях система ткани для изучения регенеративной способности нескольких типов клеток в генетическом контексте рыбок данио.
Протокол
Данио рерио хозяйства
Данио рерио размещены и воспитал в соответствии со стандартными методами 1. Прошлое конце личиночного периода, стадии развития данио рерио можно измерить с помощью ее стандартной длины (SL), либо прямо расстояние линии в миллиметрах от затылку точки верхней губы до основания хвостового плавника (posteriormost гипуральных пластины) 2. Примерно через месяц после оплодотворения (10-12 мм SL), носовые и верхнечелюстные усиков выглядят как прозрачные эпителия почки около Обонятельные ямки и на задних углах челюстей, соответственно. Как данио созревает, усиков распространяются на узкий, ус-придатки. Потому что верхнечелюстной усач больше (2-3 мм) и легче манипулировать, наш протокол применяется только к этому конкретному придаток, подобные методы, однако, могут быть адаптированы к меньшему носовой усач.
Усик Clipping
- Анестезировать взрослых данио в нужном этапе (например,., 1,5-2,5 см SL, ~ 3-6 месяцев после оплодотворения) путем погружения в 0,015% MS-222 (этил-3-аминобензоат метансульфонат) буфером до рН 7,0 в системе водоснабжения. Соблюдайте пока плавать движения остановки и жаберных вентиляции становится медленным и регулярным. В зависимости от размера рыбы, полная анестезия занимает около 2-5 минут.
- Использование аквариума ажурные, передача 1-3 рыбы за раз сложенный лист бумаги мокрым полотенцем в чашке Петри. Использование тупой лопаточкой, ориентироваться рыбы, чтобы они были параллельны друг другу и левой боковой стороной вверх. Сложите часть мокрым бумажным полотенцем над хвостовой части рыбы, покрывает все тело до крышечки (жаберные крышки), чтобы сохранить кожу и жабры влажными во время процедуры.
- Посмотреть чашку Петри под стереомикроскопа, с помощью малоуглового падающего света, чтобы осветить области головы. Сосредоточьтесь на базе левой верхнечелюстной усача, который выступает из задних вентральных углу челюсти (рис. 1).
Рисунок 1. - Плотно понять вал усач чуть дистальнее края верхней челюсти. Поднимите вал усач и вставьте челюсти с острым концом весны ножницами просто проксимальнее щипцами. Ножницы могут быть затронуты в щипцы для стабильности. Слайд челюсти ножниц вдоль вала усач, пока передний край к краю верхней челюсти. Закрыть ножницы, чтобы разрезать вал усач. Ампутировали усач, еще зажатой в щипцов, могут быть удалены для фиксации или дальнейшего наблюдения.
- Сразу передачи рыбу в небольшой резервуар чистой воды системы (~ 500 мл), содержащий одну каплю метиленового синего для контроля поверхностных грибковых инфекций. Разрешить рыбы восстановить в одночасье. Следующим утром, возвращение рыбы воспитания системы. Усик регенерации максимальна через 2 недели.
Агар Вложение парных Барбель
- Сбор рыбы на соответствующую технику эвтаназии и зафиксировать в 50 мл трубки на 4% параформальдегида-фосфатным буферным раствором (PBS) при перемешивании при температуре 4 ° С в течение ночи. Фиксирующие объем должен быть минимум в десять раз объема ткани. После фиксации распоряжаться параформальдегида отходов в специальных контейнерах и ополосните ткань тщательно в нескольких сменах PBS.
- Подготовка в 250 мл стеклянную колбу 150 мл 2% агарозном (T м ~ 37 ° C) в дистиллированной воде. Тепло с микроволновой печи или горячей плите, агитацию периодически до полного растворения. Равновесия раствора в расплаве в 50-60 ° С водяной бане.
- Соберите стандартной установки гель-электрофореза, помещая небольшие разборные формы геля (10 х 10 см; ~ 100 мл геля объем) категорически против стороны буферной камере. Добавить 2-4 мелкозубчатые образец гребни (4 х 1,5 мм).
- На ровной поверхности, заливают расплавленный агарозы в форму, чтобы только покрыть базе гребни, образуя очень мелких колодцев. Сразу же положить оставшиеся агарозном обратно в теплую ванну воды, это будет использоваться в дальнейшем для встраивания ткани (шаги 9-12). Положите длинный стеклянный Пастера пипетки в колбу держать пипетку до той же температуры, как агарозы.
- Разрешить гель, чтобы укрепиться на 20-30 минут. Удалить гребешки, затем удалить гель плесень содержащие закаленной гель из буфера камеры. Твердо ленты открытые стороны геля плесень с лабораторными ленту так, гель не выскользнуть. Эта лента должна распространяться несколько миллиметров над поверхностью агарозы, так что дополнительные агарозном могут быть добавлены позже (шаг 13).
- Поместите гель плесени на стадии стереомикроскопа. Увеличить пустой хорошо и приносят края в центре внимания.
- На поверхность агарозы, прилегающей к колодцу, пипеткой каплю воды или буфера, содержащего фиксированных экземпляров усач (например, регенерации и контроля). Усинг согнуты насекомых булавками, перетащите влажные образцы в колодец и толкать их на дно. Восток параллельно усач валов друг к другу и приведены в соответствие с противоположных длинных краев хорошо. Поверхностное натяжение поможет держать ткань в нужном положении.
- Когда все будет готово для внедрения, использования тонких кончика пипетки или углу лаборатории ткань, чтобы удалить лишнюю жидкость из скважины. Работают быстро, чтобы не дать ткани высохнуть.
- Использование нагревается стекло пипетки Пастера осторожно пипеткой свежие расплавленной агарозы и вокруг образцов для уплотнения ткани усача на месте. Не перегружайте. Перед агарозном затвердевает, в последнюю минуту корректировки, насекомых булавками.
- Место пронумерованы этикеточной бумаги образца рядом с хорошо и закрепите его с маленькой капли агарозы.
- Повторите шаги с 6 по 10 для каждой скважины образцов.
- При желании для калибровки изображения, вставить лист бумаги с печатным микрометрической шкалой (например, http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) в нижней части пустой хорошо. Свести бумаги на дно колодца и покрыть ее теплым агарозы.
- После того как все образцы заложены, поверхности геля будет неравномерным, с закаленными капли агарозы. Место гель на плоскую поверхность и аккуратно влить дополнительные расплавленной агарозы, пока верхняя поверхность равномерно. Используйте наименьшее количество агарозном необходимо получить гладкую поверхность, слишком много агарозном скроет проходящего света фотографии. Разрешить этот верхний слой, чтобы укрепиться.
- Гель теперь можно сфотографироваться на стадии стереомикроскопа для записи валового морфологии для каждой пары усач. Изображение калибровки получается путем фотографирования встроенный микрометр масштабе.
- Весь гель можно хранить, завернутые в мокрую бумажные полотенца и опечатаны в полиэтиленовом пакете при температуре 4 ° в течение нескольких недель.
- Для дальнейшего анализа, агар блоков, содержащих подобранная пара усиков могут быть вырезаны из геля с помощью скальпеля или лезвия бритвы и обрабатываемых в парафин или гистологии cryosectioning стандартными методами 3,4. Кроме того, отдельные усиков можно разрезать из агарозы с тонкой иглы, промыть в воде, и обрабатывается для других ниже по течению приложений (например, весь монтаж иммуногистохимии или конфокальной микроскопии).
Обсуждение
Данио верхнечелюстной усач является недостаточно ткани систему для изучения роста, поддержание и восстановление из нескольких типов клеток в данио. Хотя придаток усач не имеет человеческого аналоговый, типы клеток, содержащиеся в нем хорошо сохранились, что дает возможность изучать кожу, железы, меланоциты, кровообращения сосудов и нервов в оптически прозрачные и анатомически простые цилиндрические структуры. Как и в хорошо изученных хвостового плавника, усач ткань может быть привлечен к регенерации путем ампутации. Использование границе верхней челюсти в качестве анатомического ориентира ампутации плоскости может быть помещен точно, что облегчает измерение усач отрастания. Для опытного оператора, каждая операция занимает всего несколько секунд. Восстановление происходит стремительными темпами, и мы до сих пор не обнаружил ни одного короткого или долгосрочного воздействия на поведение рыб. Данио рерио с одним верхнечелюстной плавать усач, едят и размножаются так же эффективно, как не-хирургического контроля, а также имеют сопоставимые выживание до момента ткани коллекции, до 6 месяцев после операции. Физиологического воздействия этой операции по прогнозам, будет минимальным, поскольку 1) внеротовых вкусовые рецепторы осуществляется на усач также можно найти на многих других частях рыбы эпителия, в том числе губ, щек и глава 5, и 2) дифференциации вкусовые рецепторы появляются на регенерирующим усач в течение 72 часов (Леклер и соавт., неопубликованные данные). Это делает верхнечелюстной усач минимально инвазивной системы для изучения заживления ран, реваскуляризации и реиннервации в контексте взрослых позвоночных.
После хирургической индукции регенерации, усики могут быть собраны в интервалы для морфометрических измерений и / или микроскопический анализ основных тканей. Удобно, верхнечелюстной усач составляет приблизительно длину (2-3 мм) и диаметра (100-200 мм) данио эмбриона, что облегчает применение многих стандартных протоколов, в том числе парафин гистологии, cryosectioning, целые монтажа иммуногистохимии, и на месте гибридизации. Взятые вместе, эти особенности делают верхнечелюстной усача очень возможно, в естественных условиях модель для изучения ремонте и регенерации тканей.
Благодарности
Эти методы были разработаны EEL во время исследования оставляют в лаборатории JT была оказана поддержка со стороны Университета Де Пола исследовательского совета и NIH / NIDCR R01 предоставить JT (DE016678). Мы выражаем глубокую признательность усилиям Кэролайн Хантер, специалист по уходу за животными в основной объект данио CMRC и Паулина Pawluczuk, наш студент лаборанта.
Материалы
Микроскоп оборудование
Стерео микроскоп с рассекает передается и инцидентов волоконно-оптического освещения требуется для усач отсечения и агар вложение.
Усик Clipping
- Воды Рыба системы
- 2 данио пересечения танки
- MS-222 (этил-3-аминобензоат метансульфонат; Sigma Chemical # E10521-10G)
- стерильные 120-мм пластины Петри
- влажные полотенца бумаги
- тупой лопаточкой металла
- Дюмон # 55 Био Inox Пинцет (Fine Инструменты наук # 11255-20)
- Мини-Vannas весной ножницы (Fine Инструменты наук # 15000-00)
- метиленовый синий агент противогрибковые (Drs. Foster & Smith # CD-905781)
- небольшой аквариум ажурные
Коллекция тканей и агар вложение
- 4% параформальдегида в 1x фосфатным буферным раствором (PF-би-эс), аликвоты в 50 мл конические пробирки и хранят в замороженном виде при температуре -20 ° С до использования
- 1x фосфатным буферным раствором (рН = 7.27-6)
- 250 мл стеклянную колбу
- 2% агарозном в дистиллированной воде
- стандартные небольшие агарозном гель-электрофореза установки (гель размер = ~ 10 см квадрат)
- мелкозубчатые электрофорез образца гребенку (расческу размером 4 х 1,5 мм)
- теплую ванну водой (50-60 ° С)
- Лаборатория ленты
- черная эмалированная насекомых булавками, размер 000 (Fine инструменты Наука # 26000-25)
- 1-2 контактный держателей (Fine инструменты Наука # 26016-12)
- 9-дюймовый стеклянные пипетки Пастера
- пипетки лампу или насос
- Лаборатория ткани
- небольшие бумажные этикетки
- (Опционально) печатные калибровки шкалы
- влажные полотенца бумаги
- почтового индекса закрытия полиэтиленовый пакет
- Скальпель / лезвие (вырезать агар блоки)
Ссылки
- Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
- Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).
Перепечатки и разрешения
Теги
