Методология, чтобы изолировать высокой молекулярной массой и высокой геномной ДНК качества из почвы микробного сообщества описывается.
Методическая статья
Методология, чтобы изолировать высокой молекулярной массой и высокой геномной ДНК качества из почвы микробного сообщества описывается.
Почвы микробиомом является обширной и относительно неисследованными резервуар геномного разнообразия и метаболических инноваций, которые тесно связаны с питательных веществ и поток энергии в наземных экосистемах. Выращивание-независимой экологической геномной, также известный как метагеномных, подходы обещания беспрецедентный доступ к этой генетической информации в отношении реконструкции пути и функциональные обследования на высокую терапевтическую ценность и процессов конверсии биомассы. Тем не менее, почва микробиомом все еще остается проблемой в значительной степени из-за трудностей в получении высокого молекулярного веса ДНК достаточного качества для крупносерийного производства библиотеке вставки. Здесь мы вводим протокол для извлечения высокой молекулярной массой, микробного сообщества геномной ДНК из почв и донных отложений. Качество изолированной геномной ДНК идеально подходит для создания больших вставить экологические геномных библиотек для последующих применений последовательности и скрининга.
Процедура начинается с лизиса клеток. Клеточные стенки и мембран микробов лизируются как механическое (измельчение) и химической силы (β-меркаптоэтанол). Геномная ДНК затем выделяли с использованием буфера для экстракции, хлороформ-изоамиловый спирт и изопропиловый спирт. Буферы используются для лизиса и добычи шаги включают в себя изотиоцианата гуанидина и hexadecyltrimethylammonium бромида (СТАВ), чтобы сохранить целостность высоким молекулярным весом геномной ДНК. В зависимости от вашего вниз по течению приложений, изолированных геномной ДНК может быть дополнительно очищают, используя хлорид цезия (CsCl) градиент ультрацентрифугирования, что снижает примесей в том числе гуминовых кислот. Первая процедура, добыча, занимает около 8 часов, за исключением ДНК шагом количественной оценке. CsCl ультрацентрифугирования градиент, является два дня процесса. Во время всей процедуры, геномной ДНК, следует относиться осторожно, чтобы предотвратить стрижки, избегайте тяжелой вортексе, и повторяющиеся суровые пипетки.
Часть I: Добыча ДНК
Процедура
1. 8 часов не требуется, для обработки 6 образцов, исключая количественную ДНК.
Прежде чем приступить к добыче, вам необходимо предварительно холод раствор, пестик и шпатель в морозильной камере -20 ° C или с использованием жидкого азота. Кроме того, предварительное охлаждение 50 мл пробирки с 20 мл хлороформа изоамиловый спирт (24:1) на льду. Установить гибридизации духовку до 65 ° С для предварительного нагрева. Проверьте ЦТАБ решение, если оно кристаллизуется теплый до 60 ° С, чтобы расплавить кристаллы. Полное денатурации раствора и ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Мы хотели бы поблагодарить Канадский фонд инноваций, знаний британской Колумбии Фонд развития, Геном Британской Колумбии и Британской Колумбии Министерства лесного хозяйства и диапазон для поддержки текущих исследований продуктивности лесов почвы. SL была поддержана общение с ТУЛА основу финансируемого Центром микробного разнообразия и эволюции.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Рецепт
* Денатурирующих решение
4 М гуанидин изотиоцианата
10 мМ Трис-HCl (рН 7,0)
1 мМ ЭДТА
0,5% 2-меркаптоэтанола
| Денатурирующих решение: 10 мл в общей сложности | |
| Гуанидин изотиоцианат (118,16 МВт) | 4,73 г |
| 1М Трис-HCl (рН 7,0) | 100 мкл |
| 0,5 М ЭДТА | 20 мкл |
| Добавить воды до 9,95 мл в общей сложности. | |
| Автоклав. | |
| Добавить 50 мкл 2-меркаптоэтанол непосредственно перед употреблением. (5 мкл 2-меркаптоэтанол на 1 мл денатурирующих Solution) Примечание: Следует денатурирующих решение при 4 ° C. Не используйте буфер старше одной недели. Если это возможно, сделать новые буфера в использовании. | |
** Буфера для экстракции
100 мМ натрий фосфатного буфера [рН 7,0]
100 мМ Трис-HCl [рН 7,0]
100 мМ ЭДТА [рН 8,0]
1,5 М NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium бромида (СТАВ)
2% SDS
| Добыча буфер для 1 л в общей сложности | |
| 1M натрия фосфатного буфера [рН 7,0] * | 100 мл |
| 1М Трис-HCl [рН 7,0] | 100 мл |
| 0,5 М ЭДТА [рН 8,0] | 200 мл |
| 5 М NaCl | 300 мл |
| Автоклавы и хранить его при комнатной температуре. | |
| Добавить 200 мл, 5% Hexadecyltrimethylammonium бромида (ЦТАБ, автоклавного) и 100 мл, 20% SDS (автоклавного) непосредственно перед употреблением. Если ЦТАБ кристаллизовался, растопить его на 60 ° C. * 1М фосфатного буфера натрия: 57,7 мл, 1M натрия фосфат однозамещенный (NaH 2 PO 4) и 42,3 мл, 1M натрия фосфат двузамещенный (NaH 2 PO 4). Отрегулируйте рН до 7,0 Примечание: Не использовать 20% SDS, если он осадков. Это нормально, чтобы увидеть молочно подвески при добавлении SDS к решению. После добавления SDS, место буфера для экстракции при температуре 60 ° С для обеспечения SDS хорошо подвешен. | |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение