$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Строительство вектор экспрессии и выражения:
PSESAME-Cre вектор экспрессии была построена вставка Cre-кодирования фрагмента в pSESAME через AvrII и NheI сайты рестрикции с использованием стандартных методов клонирования. pSESAME кодирует белок слияния, состоящий из гистидина-теги, ТАТ-область, NLS последовательности и Cre, сокращенно HTNCre. Для выражения HTNCre pSESAME-Cre было преобразовано в TUNER (DE3) pLacI и используется для подготовки глицерина акций.
- В течение ночи культуру засевают использованием пипетки наконечник покрытием с преобразованным бактерий из глицерина акций. В течение ночи культуры состояла из LB среде с 0,5% глюкозы [об. /] и карбенициллин в конечной концентрации 50 мкг / мл и было позволено расти при температуре 37 ° С в течение 16 часов.
- На следующий день густо выросли на ночь культуры используют для инокуляции выражение культуры в соотношении 1 к 40 и был помещен в инкубатор при 37 ° C. Выражение культуры состояла из ТБ среде с 0,5% глюкозы [об. /] и ампициллин в конечной концентрации 100 мкг / мл.
- В OD 595 из 1,5 выражение культуры вызывали с 0,5 мМ IPTG в течение 1 ч.
- Впоследствии бактерий были собраны путем центрифугирования при 5000 оборотах в минуту в течение 10 минут в SLA3000 ротора.
- Бактерии гранулы хранились при температуре минус 20 ° С до очистки.
Очистка ячейки проницаемой белка:
- Замороженные гранулы бактерии ресуспендировали в 10 мл лизирующего буфера на литр культуры колбу в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Затем суспензию инкубировали с 1 мг / мл лизоцима еще на 15 минут при перемешивании при комнатной температуре.
- 25 Ед / мл benzonase был добавлен позже и инкубировали при перемешивании в течение 15 минут при комнатной температуре.
- После озвучивания на льду в течение 1,5 мин с 0,5 импульсов с при 45% мощности, 1 мл холодного буфера соль винной (БСЭ) в мл суспензии осторожно добавляют при перемешивании и выдерживают в течение 5 мин на льду. SDS-PAGE образец лизат фракции (L) принято не было.
- Очищенные лизат получали центрифугированием при 4 ° С в течение 30 мин при 30000 g. SDS-PAGE образцов растворимого (S) и нерастворимых фракций (I) были приняты.
- Супернатант переносили в 50 мл свежего труб сокола и был затем осторожно перемешивают в течение 1 ч при 4 ° С с 2 мл 50% Ni-NTA шлама на литр первичной культуры выражения.
- Суспензию упакованы в самотеком EconoPac колонке (SDS-PAGE образец проточного фракции (FT) была сделана) и дважды промывают 5 постельное объемов моющий буфер. SDS-PAGE образцах как мытье фракций (W1 и W2) были собраны.
- HTNCre-содержащие фракции элюировали 3 постельное объемами буфера элюирования и образца элюата фракции (Е) для SDS-PAGE анализа был взят.
- Имидазола удаляли диализа элюирования фракция против высоких буфера соли в два раза.
- Раствора белка еще более концентрируется диализа против буфера глицерина в два раза. Во всех диализных шаги отношение буфер для образца, по крайней мере 50. Эта процедура привела к решению глицерина семенного материала, HTNCre в обычной концентрации от 200 до 450 мкм, то есть 1 литр выражение культуры приведет к ~ 12 мг белка. Пример глицерина акций (GS) для SDS-PAGE анализа была собрана. HTNCre маточный раствор можно хранить при температуре минус 20 ° С.
Рисунок 1: SDS-PAGE анализа проб, взятых при очистке Cre рекомбиназы. Индукция выражение Cre указывается доминирующей группой в лизат фракции. Хотя часть белка нерастворимые белки Cre может быть обогащен как видно из элюата и фракции глицерина акций. L: лизат, я: Не растворяется, S: Супернатант, FT: проточные, Вт: стиральная, E: элюата, Г. С.: Gylcerol бирже. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
Белки трансдукции в мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток:
- ES клеток, несущих условной β-галактозидазы репортер 5 построить высевают как отдельные клетки, используя TrypLE ™ Express для диссоциации прилипшие клетки. После 4-х до 6 часов клетки было повторное подключение и среду удаляли.
- Впоследствии ЭС клетки инкубировали с HTNCre среде, содержащей в течение 16 часов.
- Соответствующее количество белка HTNCre (соответствует 10 мкМ) из глицерина акции разбавляли в среду ES, а затем стерильной фильтрации (0,22 мкм).
- После среду белков трансдукции был изменен обратно в нормальный средний рост.
- После двух дней клетки промывали PBS и фиксировали 4% Параформальдегид (PFA) в течение 10 минут.
- Два дополнительныхных этапов промывки с PBS были казнены до X-Gal окрашивание проводилось.
- Фиксированные клетки были покрыты слоем X-Gal красящим раствором 6 и инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° C.
Представитель Результаты:
На следующий день X-Gal окрашивание раствора стремилась и клетки были покрыты слоем PBS для микроскопии анализа. От 80 до 100% от рекомбинированное клетки можно было наблюдать в мышиных клетках ES судить по β-галактозидазы.
