$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
А. микротехнологий из 3-х слойные устройство perifusion микрожидкостных
Нижняя Ну Мастер протокола (150 мкм глубоких скважин)
- Чистая пластины использованием лезвие в случае необходимости. Очистите ацетон, метанол, и МПА. Выполните плазменной обработки на 50 Вт в течение 30 сек
- Спиновые SU8-100 @ 2000 оборотов в минуту. [Шаг 1: 500 оборотов в минуту, 10 с, 100 об / с, Шаг 2: 2000 оборотов в минуту, 30 с, 300 об / с].
[Примечание: не держите пластины с помощью пинцета после вращения SU8] - Мягкие выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 20 мин, а при 95 ° С в течение 50 мин.
- Пластины под действием УФ света через желаемую маску. Доза для 150 мкм высота составляет 650 мДж / см 2.
- Сообщение экспозиции выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 1 мин, а при 95 ° С в течение 12 мин.
- Разработка пластин в SU8 разработчика в течение 15 мин.
Microchannel Мастер протоколу (500 мкм глубоких скважин)
- Чистая пластины использованием лезвие в случае необходимости. Очистите ацетон, метанол, и МПА. Выполните плазменной обработки на 50 Вт в течение 30 сек
- Спиновые SU8-2150 @ 1000 оборотов в минуту. [Шаг 1: 500 оборотов в минуту, 10 с, 100 об / с, Шаг 2: 1000 оборотов в минуту, 30 с, 300 об / с].
- Мягкие выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 15 мин, а при 95 ° С в течение 2 часов и 30 минут.
- Пластины под действием УФ света через желаемую маску. Экспозиционной дозы на 650 мкм, высота 685 мДж / см 2.
- Сообщение экспозиции выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 5 мин, а при 95 ° С в течение 35 минут.
- Разработка пластин в SU8 разработчика в течение 20-30 мин.
PDMS приготовления раствора
- Полидиметилсилоксан (PDMS) раствор готовят тщательного перемешивания 10 частей силиконового эластомера с 1 частью отвердителя стандартного Sylgard 184 комплекта.
- Пузырьками генерируется в решение PDMS в процессе смешивания происходит с помощью вакуум-эксикаторе.
- Без пузырей решение PDMS медленно обойтись на SU8 мастеров и пустые чашки Петри для третьего слоя.
- Температура горячей пластине установлен до 75 ° С и PDMS лечится при этой температуре в течение 2 часов
- Входы, выходы и обмен скважин штампуют используя соответствующий размер отверстия перфоратором.
- Слои соединены вместе на предметное стекло (размер 0,1 мм) с помощью портативного устройства плазмы.
Б. Экспериментальная установка
- Поток 70% этанола через микро-устройства для стерилизации. Поток DI воды, чтобы смыть этанола. Заливать 50 мл 0,5% BSA через устройство для предотвращения неспецифической адсорбции инсулина микроканальных стен.
- Градиент глюкозы рампы и другие связанные с градиентами порожденных LabView программное обеспечение, которое взаимодействует с шприцевые насосы проходят тестирование, чтобы убедиться, градиенты являются стабильными.
- 25-30 мышей островки инкубировали с 5 мкМ Fura-2/AM (кальций показатель, Молекулярные зонды, CA) и 2,5 мкМ родамина 123 (Rh123, митохондриальная Индикатор потенциалов, Sigma, MO) в течение 30 мин при 37 ° С в Кребс-Рингер буфер (KRB), содержащий 2 мМ глюкозы
- Мышей островков тщательно пипеткой в микрожидкостных устройств perifusion через входное отверстие.
- Микрожидкостных сеть, то установку, подключив входе шприцевые насосы использованием трубки Tygon и Y-разъем и выход на долю коллектора. Устройство сидит на стадии нагрева (37 ° С) на микроскоп и впускной трубы нагревают на плите, чтобы поддерживать температуру в камере и раствора при температуре 37 ° C.
- Сразу же после установки, мышей островки perifused с KRB, содержащий 2 мМ глюкозы в течение 10 мин, а затем глюкозы рампы (2 мм 25 мм) в течение 25 мин.
- Покадровый изображения собраны и проанализированы каждые 15 с программным обеспечением SimplePCI. Perifusate также собираются каждую минуту с использованием фракция коллектор для анализа секреции инсулина использованием ИФА.
Представитель Результаты
Мышь островки были perifused с линейным градиентом 2-25 мМ глюкозы. Как показано на рисунке 1, приток кальция и секрецию инсулина срабатывает примерно через 13 минут perifusion, что соответствует 6 мМ глюкозы. Изменения в митохондриальной потенциалы видели ранее, как ожидается, около 11 минут. Эти данные демонстрирует преимущество использования этой микрожидкостных сети, чтобы охарактеризовать островок физиологии.
Рисунок 1. Физиологические ответы на островковых клеток стимуляции.