Методическая статья
Регулируемые эндоцитоза управляет клеточной поверхности уровня экспрессии большинства мембранных белков. Здесь мы используем приводимым, мембраны impermeant реагентов биотинилирование для измерения скорости endocytic переносчика дофамина (DAT), polytopic белков мембраны. Метод обеспечивает прямой подход к измерению endocytic скорость большинства белков плазматической мембраны.
Плазменные белки мембраны большая, разнообразная группа белков входят рецепторы, ионные каналы, транспортеры и насосы. Активность этих белков отвечает за целому ряду ключевых клеточных событий, включая доставку питательных веществ, клеточной возбудимости, и химических сигналов. Многие мембранные белки плазмы динамически регулируется endocytic торговлей людьми, который модулирует функции белка путем изменения экспрессии белка поверхности. Механизмы, обеспечивающие белка эндоцитоза, сложны и не до конца понимали многие мембранные белки. Для того чтобы полностью понять механизмы, которые управляют endocytic оборота данного белка, очень важно, чтобы скорость endocytic белка с точно измерена. Для многих рецепторов, прямые измерения скорости endocytic часто достигнуто использованием меченых лигандов рецепторов. Тем не менее, для многих классов мембранных белков, таких как транспортеры, насосы и ионные каналы, нет удобного лигандов, которые могут быть использованы для измерения endocytic ставки. В настоящем докладе мы опишем метод обратимой биотинилирование, что мы используем для измерения переносчика дофамина (DAT) endocytic ставки. Этот метод обеспечивает прямой подход к измерению интернализации ставки, и могут быть легко использованы для торговли исследования большинства белков мембраны.
Описание процедуры:
Используя этот подход, белков клеточной поверхности, которые ковалентно меченные биотином По имеющейся внеклеточной остатков лизина использованием мембраны impermeant, дисульфид-связанных биотинилирование реагента (сульфо-NHS-SS-биотин), при торговле ограничительных условий (например, низкая температура) (см. рис 1. Для иллюстрации). Один комплект клетки смещено к торговле людьми разрешительных условий (37 ° С) и биотинилированного белков усвоить. Другой набор клеток сохраняются при низкой температуре, в качестве контроля для: 1) общий белок поверхности в момент = 0, и 2) зачистки контроля. После короткого периода интерн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Общие проблемы: Самая частая проблема, возникающая в этих экспериментах является низкая эффективность полосы. Эффективность полосы имеет решающее значение в том, чтобы уметь интерпретировать результаты. Если полоса была очень эффективной, это не возможно сделать вывод, что любой биотинилированного белков в интернализации полосы были, по сути, внутренним от поверхности. Полосы ≥ 90% эффективности являются оптимальными, и отбросить какие-либо результаты, если полоса падает ниже этого уровня. Пример плохой полосы по.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта работа финансировалась NIH грант № DA15169 к HEM
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение