Имплантация Ferumoxides Маркированный мезенхимальных стволовых клеток человека в Дефекты хряща

Краткое содержание

Цель презентации является демонстрация высокой воспроизводимостью метод для создания матрицы связаны имплантатов стволовых клеток в дефектов хряща, которые могут быть визуализированы с МРТ. Стволовые клетки помечены FDA утвержденных Ferumoxides, смешанный с агарозы, внедренных в хряще дефектов и полученную с использованием сканера 7T MR.

Аннотация

Области тканевой инженерии интегрирует принципы инженерии, клеточной биологии и медицины по отношению к регенерации специфических клеток и функциональной ткани. Матрица связанных стволовых клеток имплантаты (MASI) направлены к регенерации хряща дефекты, связанные с артритом или травматического травмы суставов. Взрослых мезенхимальных стволовых клеток (МСК), были способны дифференцироваться в клетки хондрогенного линии и показали многообещающие результаты в клеточной суставного хряща технологии ремонта. Аутологичных МСК может быть выделен из различных тканей, может быть расширен в клеточных культурах, не теряя их дифференциации потенциал, и продемонстрировали хондрогенного дифференциации в пробирке и в естественных условиях ^{1, 2.}

В целях обеспечения местного удержания и жизнеспособности пересаженных МСК в дефектов хряща, строительные леса необходимы, который также поддерживает последующей дифференциации и пролиферации. Архитектура ткани формирование эшафот руководства и разрешений внеклеточного матрикса, производства стволовых клеток, расширяться. Предыдущие исследования показали, что 2% агарозном леса может поддержать развитие стабильных гиалиновых хрящей и не вызывать иммунный ответ ^3.

Долгосрочное сохранение пересаженные стволовые клетки в MASI имеет решающее значение для регенерации хряща. Маркировка МСК с наночастицами оксида железа обеспечивает долгосрочный в естественных условиях слежения с неинвазивных методов визуализации МР ^4.

Эта презентация будет демонстрировать методы маркировки МСК с наночастицами оксида железа, поколению клеточных агарозном конструкций и имплантации эти конструкции в хряще дефектов. Помечены конструкции могут быть отслежены неинвазивно с МР-изображений.

Протокол

1. Маркировка hMSCs с Endorem

1. Клетки выращивают до 80% слияния по крайней мере за 18 часов до маркировки.
2. За это время, маркировка СМИ получают путем добавления Endorem к образцу в дозе 100 мкг Fe / мл сыворотки среде.
3. После клетки выращивают до слияния, питательных сред отсасывают и клетки промывают 1x с PBS или сыворотки среде.
4. Далее, промывочный раствор отсасывают и ранее подготовленный СМИ маркировке добавляется. Затем клетки инкубировали при 37 ° C, 5% СО ₂ в течение 4 часов.
5. После инкубации в 4 часа, маркировка СМИ отсасывают и клетки промывали PBS и трипсином, как обычно.
6. После трипсином, клетки промывают 3 раза с PBS и центрифугировали при 400rcf течение 5 минут.
7. После этой промывки, клетки ресуспендируют, считая, оцениваются на жизнеспособность, и используется по мере необходимости для экспериментов.

2. Подготовка агарозном

1. После клетки были помечены пришло время приготовления раствора агарозы.
2. На мелкого масштаба, 80 мг агарозы порошка взвешивают и добавляют в 2 мл PBS.
3. Это решение затем слегка встряхивают и автоклавировать.
4. Примерно через 40 мин, жидкий раствор агарозы может быть выведена из автоклава. Объем должен быть измерены и соответствующим образом скорректированы с разогретой PBS.
5. Затем раствор охлаждают до 42 ° C

3. Создание MASI

1. Когда раствор агарозы достигла нужной температуры, клетки подсчитываются и центрифугировали в течение последнего времени в трубку 1,5 мл Eppendorf.
2. После центрифугирования супернатант удаляют, а клетки смешиваются с DMEM достичь концентрации 30 х 10 ⁶ клеток / мл.
3. Теперь клетки смешиваются с 42 ° С теплыми агарозы.
4. Холодный наконечник пипетки может вызвать агарозном закрепить в наконечнике, поэтому он рекомендуется для подогрева наконечник с помощью пипетки горячей стерильной PBS вверх и вниз
5. Теперь же объем агарозы как средства массовой информации занимают и тщательно перемешивают с сотовым медиа-суспензии так, что однородная суспензия будет создан.
6. Держите пробирку Эппендорфа в разогретой водяной бане, помешивая, чтобы агарозном не остыть достаточно, чтобы затвердеть.
7. Когда подвеска однородной, клетки имплантируются в дефект.

Рисунок 1. Корональные Т2 взвешенных изображениях SE (TR 4000 мс / TE 18,27 мс) коленной чашечки образца с имплантированными hMSCs в хрящах дефектов.

Обсуждение

Описанные протокол обеспечивает воспроизводимые способ этикетке МСК с наночастицами оксида железа и внедрить эти меченых МСК на дефекты хряща. Эта техника позволяет неинвазивным изображением трансплантации стволовых клеток в дефектов хряща с МРТ, которая позволяет раннего выявления MASI недостаточности. Дислокации или истечение меченых клеток может быть диагностирована на основе исчезновение метки из трансплантации сайта на МРТ. Ранняя диагностика этих событий желательно и не допускал бы пациента от ненужных альтернатив...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
D-MEM с высоким содержанием глюкозы	Реагент	Sigma-Aldrich	D5648
PBS (без Ca++, Mg++)		GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Трипсин-ЭДТА 0.05%		Invitrogen	25399-120
FBS		Hyclone	SH30071.03
Пенициллин/Стрептомицин		GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Ферумоксиды (Endorem)		Guerbet
Агароза тип VII		Sigma-Aldrich	A9045	Развести агарозу в PBS до конечной концентрации 4%