Восстановление мыши ооцитов

Краткое содержание

Этот протокол иллюстрирует технику для извлечения яйцеклеток или на ранней стадии оплодотворения эмбрионы из яйцевода мышей. Способность идентифицировать infindibulum и вставьте тупой иглой в конце важно правильно выполнять процедуры.

Аннотация

На сегодняшний день только несколько исследований сообщили об успешном проведении манипуляций Реготузсиз эмбриогенеза или репродуктивной биологии. Вместе с Реготузсиз генетического фонда Центр (http://stkctr.biol.sc.edu), мы характеризующие основные различия, необходимые для разработки этой системы. Основной задачей было оптимизировать ооцитов / начале поиска эмбриона.

Протокол

Эмбрионов / ооцитов поиска

1. По крайней мере, за два часа до извлечения эмбрионов / ооцитов, KSOM находится в 37 ° C CO ₂ инкубатора и FHM должна быть талой с ° -20. Стеклянную посуду, содержащие три вогнутые неглубоких скважин используется для дома капель KSOM в инкубаторе. Чтобы избежать обезвоживания, KSOM и блюда помещаются в контейнер закрытой крышкой, что есть вода на дне. Этот аппарат предотвращает испарение без использования минерального масла.
   
   
2. Яйцеводы от овуляции женщины размещаются в средствах массовой информации FHM. Для обеспечения ориентации и нетронутыми infindibulum, небольшая часть яичника вырезать вместе с яйцевода и небольшого участка матки. Тупой 30 иглы используется изгнать эмбрионов / ооцитов из яйцевода, вставив тупой иглой в infindibulum. Infindibulum должен быть использован для получения эмбрионов с яйцевода трубы слишком мал для иглу, чтобы пройти. В том случае, infindibulum разрушен, яйцевод должны быть либо открытыми нарезанный или эмбрионов выдавливается.
   
   
3. Эмбрионы / ооциты находятся в СМИ FHM, сосредоточив внимание на микроскоп капелек жира, которые опустились на дно чашки Петри. Эмбрионов / ооцитов изоляции может быть достигнуто при 20x, поскольку это обеспечивает большую область просмотра, чем большим увеличением. Эмбрионов / ооцитов выглядеть круглых капелек жира, которые имеют четкую кольцо вокруг него. Пипетирование ртом, используя вытащил стеклянный капилляр, используется для перемещения эмбрионов / ооцитов к KSOM для инкубации и дальнейшей манипуляции.

Процедура извлечения ооцитов

Подготовка

1. Оттепель FHM и подготовить kSOM.
2. Несколькими часами ранее, место kSOM в яйце контейнер поиска и место в совете ящик с водой на дне, месте в CO ₂ инкубаторе.
3. Принесите клетки в лабораторию и уничтожить уборки женщин.
4. Вырежьте яйцевода будьте осторожны, чтобы сократить некоторые из яичника и некоторые из матки, чтобы вы не отрезали часть яйцевода.
5. Место в FHM СМИ в небольших чашках Петри.
6. Налейте еще пару FHM СМИ чашки Петри, которые будут использоваться для промывки.

Промывка

1. Использование промывки иглы (30 калибр тупой), подключенных к 1 мл иглой со спиральной конца.
2. Возьмите один яйцевод в то время, и с помощью иглы, вставить в воронки около часть яичника левого прилагается. Если воронки разрушается и не может быть использована, а затем взять два щипцы и держите один конец яйцевода. С другой forcep, слегка сжать, как зубная паста трубки, чтобы извлечь какой-либо эмбриона.
   
   Примечание: Это создаст большое количество беспорядок в чашке Петри, как много ткани придет с ним, так что вы можете использовать другой чашке Петри после этого.
   
   
3. Чтобы увидеть эмбрионы, фокус микроскопа на жире кусочки и выглядят для круглых "кусок жира" с четким кругом вокруг него.
   
   Примечание: эмбрионы имеют тот же вид, как жир, так что может быть трудно найти. Эмбрионов опускаются на дно, так что смотрите там.
   
   
4. У вагинальных мазках получателя женщин. На этом этапе, они должны быть псевдобеременным.

Обсуждение

В этой статье мы покажем извлечения ооцитов от овуляции-индуцированного (superovulated) Реготузсиз. Использование суперовуляции (в отличие от природных эстрального цикла) является общим в связи с гораздо большей полученные числа. Тем не менее, осторожность должны быть приняты в интерпретации результатов использования таких яйцеклеток / эмбрионов, так как и гормонов, используемых, чтобы вызвать овуляцию и культивирования может оказывать действие.

Когда эстрального было подтверждено, женщины euthenized и яйцеводы восстановления наряду...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Промывочная игла	Инструмент	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G тупоконечная
Пинцет (2)	Инструмент	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Животное	Peromyscus Genetic Stock Center
Ножницы	Инструмент	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Среда FHM с HEPES-буфером	Реагент	Specialty Media	MR-025-d
Среда для культивирования эмбрионов KSOM (5x 10 mL)	Реагент	Specialty Media	MR-020P-5F
Ротная пипетка	Инструмент			Изготовлена из вытянутых стеклянных капилляров, прикрепленных к резиновой трубке
Чашка для удержания ооцитов	Инструмент			Стеклянный контейнер с вогнутыми углублениями