Оптимизированная фибринового геля из бисера тест для изучения ангиогенеза

Краткое содержание

Это видео демонстрирует протокол в анализе ангиогенеза пробирке, что повторяет несколько стадий ангиогенеза. Покадровый изображения прорастания, просвет образования, ветвление и анастомоза - ключевые особенности ангиогенез - это показано на рисунке.

Аннотация

Ангиогенез представляет собой сложный многоступенчатый процесс, в котором, в ответ на ангиогенных стимулы, новые суда создаются из существующих сосудов. Эти шаги включают в себя: деградации базальной мембраны, пролиферации и миграции (прорастание) эндотелиальных клеток (ЕК) в внеклеточного матрикса, выравнивания ЕС в шнуры, ветвящийся, просвет образования, анастомоза, и формирование новой базальной мембраны. Многие в пробирке тесты были разработаны для изучения этого процесса, но большинство лишь имитируют определенные этапы ангиогенеза, и морфологически судов в анализах часто не похожи на судах в естественных условиях. На основе более ранних работ Nehls и Drenckhahn, мы оптимизировали в пробирке ангиогенеза анализа, который использует пупочной вены человека ЕС и фибробластов. Эта модель повторяет все ключевые ранних стадий ангиогенеза и, что немаловажно, судов дисплей патент межклеточных люмен окруженной поляризованной ЕС. ЕС покрыты на микроносителях cytodex и встроенных в гель фибрина. Фибробласты слой поверх геля, где они обеспечивают необходимый растворимых факторов, которые способствуют прорастанию ЕС с поверхности бусины. После нескольких дней, многочисленные суда присутствуют, которые можно легко наблюдается при фазово-контрастной и покадровой микроскопии. Это видео демонстрирует основные этапы в создании этих культур.

Протокол

ПОДГОТОВКА КЛЕТОК

1. Вызовите HUVEC и фибробластов в M199/10% FBS / Пен-Strep (1:100) за 1-2 дня до бисером.
2. Коммутатор средних EGM-2 (Clonetics) день до бисером для HUVEC и позавчера вложение для фибробластов.
3. Концентрация ~ 400 HUVEC в шарик не требуется.
4. 20000 фибробластов на лунку необходимо.

Покрытие бисера с HUVEC - ДЕНЬ -1

1. Trypsinize HUVEC.
2. Разрешить бусин для урегулирования (НЕ ЦЕНТРИФУГА!). Аспирируйте супернатант и мыть бисером кратко в 1 мл теплой EGM-2 среды.
3. Mix 2500 бисером ж / 1x10 ⁶ HUVEC в 1,5 мл теплой EGM-2 среды в трубке СУИМ. Поместите его вертикально в инкубаторе. (Этого будет достаточно для ~ 10 скважин. Масштабирование при необходимости)
4. Инкубируйте в течение 4 часов при 37 ° С, пожимая трубку каждые 20 мин. (Хорошо покрытие имеет решающее значение для прорастания.)
5. Через 4 часа, передача покрытием бисером T25 колбу в 5 мл EGM-2 и оставить O / N.

Вложение ПОКРЫТИЕМ бусины фибринового геля - ДЕНЬ 0

1. Подготовка 2,0 мг / мл фибриногена решение (см. рецепт раздел).
2. Добавить 0,15 ед / мл апротинина к фибриногена решение.
3. Передача покрытых бисером 15 мл коническую трубку и пусть бисером обосноваться. Ресуспендируют бисером в 1 мл EGM-2 и передачи в 1,5 мл трубки центрифуги.
4. Вымойте бисером 3X с 1 мл EGM-2 с помощью pipeting вверх и вниз МЕДЛЕННО.
5. Граф бусины на покровное и ресуспендируют в фибриногена раствора при концентрации ~ 500 бусин / мл.
6. Добавить 0,625 ед / мл тромбина в каждую лунку.
7. Добавить 0,5 мл суспензии фибриногена / гранулы в каждую лунку 24-луночного планшета.
   
   Изменение пипетки для каждой скважины!
   
   
8. Смешайте тромбина и фибриногена, идя вверх и вниз, осторожно кончиком пипетки ~ 4 до 5 раз. Будьте осторожны, чтобы не делать большие пузыри.
9. Оставьте пластину в течение 5 мин в капюшоне, а затем поместить его в 37 ° С-инкубаторе в течение 10-15 мин для получения сгустка.
10. В ожидании сгусток, trypsinize фибробластов.
11. Добавить 1 мл EGM-2 на лунку падение мудрым.
12. Семенной фибробластов поверх геля фибрина в концентрации 20 000 клеток на лунку.

ПРИМЕЧАНИЯ:

Обычно, когда геля фибрина образуется, то вы увидите крошечных пузырьков в геле. Не волнуйтесь, они исчезнут в течение 3-4 дней.

Изменение средств массовой информации каждый день, то есть 2 дня, 4, 6, и т.д. ..

Днем 3 или 4, вы должны начать видеть прорастания.

Обсуждение

Существует растущий консенсус, что трехмерная (3D) в анализах пробирке ангиогенеза предлагаем модель, которая гораздо ближе к реальной среде, чем в естественных условиях можно добиться, используя 2D культур. Очевидно, что превосходное 3D-системы должны быть воспроизводимы, и будут способны имитировать некоторые из основных шагов ангиогенеза. Хотя несколько предыдущих 3D анализов были разработаны, многие из них либо использовать трудно получить микрососудистых клеток, или только резюмировать некоторые из этих этапов. В этом видео, мы описыва...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сферы Cytodex-3	Реагент	Amersham	17-0485-01	10 g/флакон. 1.0.5 g сухих сфер гидратируют и набухают в 50 mL PBS (pH = 7.4) в течение не менее 3 h при RT. Используйте пробирку объемом 50 mL и поместите ее на шейкер.2.Дайте сферам осесть (~ 15 min). Удалите супернатант и промойте сферы в течение нескольких минут свежим PBS (50 mL).3.Удалите PBS и замените его свежим PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL или 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Поместите суспензию сфер в силиконизированный стеклянный флакон (Windshield Wiper или Sigmacote).5.Стерилизуйте сферы путем автоклавирования в течение 15 min при 115°C.6.Храните при 4°C.
Апротинин	Реагент	Sigma-Aldrich	A-1153	10 mg/флакон. Восстановите лиофилизированный апротинин до концентрации 4 U/mL в деионизированной воде. Пропустите через стерильный фильтр. Разлейте на аликвоты по 1 mL. Храните при -20 °C.
Фибриноген типа I	Реагент	Sigma-Aldrich	F-8630	1 g. Растворите фибриноген в DPBS до концентрации 2 mg/mL. Обратите внимание на % свертываемого белка и отрегулируйте концентрацию соответствующим образом. Нагрейте на водяной бане при 37 °C для растворения фибриногена. Перемешайте, переворачивая пробирку. Не используйте вортекс. Пропустите через стерильный фильтр 0.22 um
Тромбин	Реагент	Sigma-Aldrich	T-3399	22 mg = 1,000 единиц. Восстановите в стерильной воде до концентрации 50 U/mL. Разлейте на аликвоты по 0.5 mL. Храните при -20 °C.