Анализ развития Морфологические Фенотип как функция концентрации белка в почкующихся дрожжей

Summary

Удаление гена и белка гиперэкспрессия общие методы изучения функций белков. В этой статье мы опишем протокол для анализа фенотипа развития в зависимости от концентрации белка на население и одноклеточных уровней в Saccharomyces CEREVISIAE.

Abstract

Удаление гена и белка гиперэкспрессия общие методы изучения функций белков. В этой статье мы опишем протокол для анализа фенотипа развития в зависимости от концентрации белка на население и одноклеточных уровней в

Protocol

А. культуры клеток и белка индукционные

В этом разделе описывается культура клеток условиях клеточного цикла синхронизации с нокодазолом, после индукции экспрессии белка с регулируемой промоутер в клетках дрожжей.

1. Дикий штамм дрожжей типа W303 (leu2-3, 112 TRP1-1 can1-100 URA3-1 ade2-1 his3-11, 15) превращается с высокой копию (2μ) плазмидной ДНК, которая содержит наши гены, представляющие интерес (ENTH2) под контролем из-метионин репрессируемый промотора (MET25). 2 мМ метионин достаточно, чтобы подавить активность промотора, в то время как средства массовой информации не хватает метионина позволяет максимальн....

Discussion

Этот протокол описывает, как следить за развитием морфологических фенотип (дрожжевая клетка не в состоянии пройти надлежащее деление клеток) на белок гиперэкспрессия. При выполнении этой процедуры важно помнить, чтобы урожай дрожжевых клеток путем гранулирования в рекомендуемой скорости центрифугирования, как более высокие скорости может привести к повреждению клеток и неясными результатами. Метиленовый синий и белый Calcofluor следует добавить живые клетки непосредственно перед изображениями так как они являются токсич.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Нокодазол	Реактив	Сигма-Олдрич	M1404
Метиленовый синий 1% (в/об)	Реагент	VWR international	VW6276-0
Калькофтор белый	Реактив	Sigma-Aldrich	F3543
Реактив вазелин		VWR international	VW3339-2