Пластиковые вложения и секционирования Xenopus laevis Эмбрионы

Краткое содержание

Пластиковые разделы сохранить истинный морфологии ткани в тонких срезов тканей, которые могут быть immunostained с люминесцентными вторичными антителами, что делает этот метод более полезным, чем парафин или замороженных срезов для многих типов тканей. Метод окрашивания, пластик вложение и секционирования показано в этом видео.

Протокол

Фиксация

1. Передача целых зародышей или расчлененный эксплантов в MEMFA или 3,7% FA + PBS в небольшой пузырек сцинтилляционных стекла (Fisher кошка # 03-339-25B). Инкубируйте флакон на nutator при комнатной температуре, только в течение 2 часов, и не более того. Не оставляйте эмбриона в Англии более чем на 2 часа. Более инкубации в ФА сделает эмбриональной ткани труднее и в результате плохого проникновения антител в процессе обнаружения.
   
   
2. Аспирируйте большинство из Англии и добавить фиксатором Дента до верхней части флакона (~ 4,5 мл). Аккуратно переверните флакон на несколько раз мыть эмбрионов в Дента, обмен с другим 4,5 мл свежего Дента, и инкубировать их в -20 º C в течение по крайней мере 48 часов. Ночь недостаточно. Этот шаг делает эмбрионов более проницаемой для антител. Эмбрионы могут храниться в таком состоянии в течение нескольких недель.

Иммунофлюоресценция

1. Увлажняет образца. Выдержите его в серии градуированных метанола, а именно:
   
   

   75% MeOH / H 2 O	10мин
   50% метанола / PBS	10мин
   25% метанола / PBS	10мин
   PBS	10мин
   PBS	10мин

   
   
2. Сделать 1,5% агарозном / PBS 60 мм пластин с пластиковой посуды. Налейте PBS на вершине агарозном после того, как становятся твердыми.
   
   
3. Hemi-секционирования эмбрионов: Положите эмбрионов в 1,5% агарозном / PBS пластины. Захватите эмбриона с парой щипцов и разрезать его пополам через центр эмбриона использованием тонким лезвием бритвы. Выберите те, которые вы успешно разрезать пополам с прямой плоскостью резания.
   
   
   
   
4. Передача пополам эмбрионов в стеклянный пузырек сцинтилляционных PBT. Обмен с 4,5 мл 20% козьего сыворотки + ПБТ. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 часов на nutator (блокировка).
   
   
5. Подготовка соответствующего разведения первичных антител в PBT. 0,5 мл этого в образцах не требуется. Например, я использовал 1 / 200 разведения кроликов анти-C-кадгерина паб для изучения субклеточных локализации С-кадгерина в 5 мм, пластиковые секции.
   
   
6. Аспирируйте блокирующий раствор и добавляют 0,5 мл разбавленного первичного антитела. Положите флаконов в стоячий положение на держателе трубки пенополистирола. Инкубируйте течение ночи при 4 ° С на nutator.
   
   
7. Удалить разбавленный первичного антитела (это разбавленный первичного антитела могут быть сохранены и повторно использованы в ближайшие 1-2 недели). Промыть 4,5 мл из PBT в 4 раза (40-60 минут) при комнатной температуре.
   
   
8. Обмен с 0,5 мл 1 / 100 разбавление биотин-сопряженных вторичными антителами в PBT. Инкубируйте течение ночи при 4 ° С на nutator. Обложка флаконах с алюминиевой фольгой для защиты от света биотин.
   
   
9. С этой точки зрения следует соблюдать осторожность для защиты образца от света, т. е. держать флаконах при некоторых крышкой или алюминиевой фольгой.
   
   
10. Удалить биотин-вторичные антитела (это может быть также использован в ближайшие 1-2 недели). Промыть или 4,5 мл из PBT в 4 раза (40-60 минут) при комнатной температуре.
    
    
11. Обмен с 0,5 мл 1 / 200 разбавление флуоресцентно меченных (FITC, штат Техас, красный и т.д.) стрептавидином в PBT. Инкубируйте течение ночи при 4 ° С на nutator.
    
    
12. Удалить стрептавидином (это может быть повторно использованы, тоже). Промыть 4,5 мл из PBT 3 раза (15 - 30 минут) при комнатной температуре.
    
    
13. Fix эмбрионов в 4,5 мл 3,7% FA + PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
    
    
14. Промыть 4,5 мл ФСБ в два раза.
    
    
15. Дегидрировать образца. Выдержите его в серии градуированных этанола, а именно:
    
    

    30% этанола / H 2 O	10 мин
    50% этанола / H 2 O	10 мин
    75% этанола / H 2 O	10 мин
    100% этанола	10 мин

    
    
    
16. Образца могут быть сохранены в 100% этанола при 4 ° С с крышкой для защиты от света.

Инфильтрация

1. Сделать Technovit 7100 инфильтрации смеси. Я обычно берут 15 мл жидкости в базу 50 мл коническую пробирку, добавляют 150 мг отвердителя я и смешайте его покачиваясь на nutator течение 15 минут. Это проникновение смесь можно хранить при температуре 4 ° С на срок до одного месяца.
   
   
2. Проникнуть образца с инфильтрацией смеси путем обмена с градуированной серии Technovit проникновения смеси / EtOH комбо, а именно:
   
   
   1. 50% Technovit / EtOH - 1 час
      
      
   2. 100% Technovit - 1 час
      
      
   3. 100% Technovit - ночь
      
      
3. Specimeя может быть сохранен в 100% проникновения смеси на срок до одного месяца при 4 ° C. Положите крышку на образцы, чтобы защитить их от света.

Вложения

1. Сделать Technovit 7100 вложение смесь: возьмите 0.75ml от проникновения смеси в 1,5 мл трубки и добавить 50 мл отвердителя II. Смешайте это путем обращения трубки в несколько раз.
   
   
2. Использование пластиковой пипетки передачу, взять один экземпляр проникли ночью в 0,5 мл тонкие стенки трубы ПЦР. Удалите большинство супернатант.
   
   
3. Добавить 0,25 мл вложения смесь, сделанную в шаге # 1 настоящего параграфа, "Погружение", к образцу. Восток пополам эмбриона, чтобы сделать вскрытие плоскости, стоящих перед нижней части трубки, осторожно подталкивать с тупым наконечником вскрытия иглой (деревянной ручкой рассечение иглы).
   
   
4. Закрыть крышкой и инкубировать трубка в темном месте в течение примерно четырех часов, чтобы позволить пластиковых полимеризации.
   
   
5. Сделать Technovit 3040 перемешать. Принимать по 1 грамм порошка для взвешивания блюдо, и добавьте 0,5 мл жидкости. Сразу же, смешать порошок и жидкость использованием bluetip. Залить сверху закаленной spacimen. Этот желтый Technovit 3040 позволит предотвратить весь пластиковый блок из выходящих из трубы.

Секционирование

1. Протрите Histoknife H с ксилолом (EtOH часто не достаточно хорошо) и установить его на свой микротоме. Угол лезвия примерно в 45 °. Протрите этапе площадь перед лезвие с ксилол, тоже, потому что чистота этой области имеет решающее значение для качества секционного ломтиками.
   
   
2. Вырезать стороне трубки и кожуры кончик использованием картона ножом.
   
   
   
   
3. Установить образец в держатель патрон микротоме.
   
   
4. Прикрепить "пресс-к-печать" кремний изолятор на предметное стекло, чтобы сделать монтаж камеры по разделу ломтиками. Плотно прижмите изолятор, чтобы скользить по чистой настольные и посмотреть с другой стороны, чтобы убедиться, что изолятор полностью прилагается без каких-либо воздушных пузырьков. Залить чистой и теплой дН ₂ O (~ 40 ° C) с бассейном на слайд с помощью пипетки Пастера до уровня, на котором видно, что поверхность воды становится плоским, а не вогнутые или выпуклые формы.
   
   
5. Начните делать разделе ломтиками. Для иммунофлюоресценции исследования, я делаю 5 ломтиков мм разделе. Ибо в месте образцы гибридизации, толщина ломтиков можно регулировать в диапазоне от ~ 3 - 8 мм, в зависимости от целей и интенсивности сигналов.
   
   
6. Carry разделе ломтиками со сцены перед лезвием к монтажной камере с водой, используя маленькую кисть. Держите кисть с кусочком поверх воды в бассейне и падение срез вниз к воде, сбивая его с тупым кончиком иглы рассечение. Часть будет расширяться в круглую форму, как только она попадает на поверхность воды.
   
   
7. Когда большинство площадь водной поверхности монтажа камера заполняется раздел ломтиков, поглощать почти половина из воды с помощью пипетки Пастера. Инкубировать слайд на слайде теплее ночь, чтобы сделать выборку полностью высохнет.
   
   
8. Counter-пятно с 1 мл DAPI (0.1mg/ml в ТЕ) в течение пяти минут. Аспирируйте DAPI и сухой образец.
   
   
9. Удалите изолятор силиконовой резины от слайд. Теперь фотографии можно взять пробы. Магазин образца при 4 ° С, защищенном от света месте.

Материалы

Первичные антитела против антигена или ваш эпитопа теги: Сделайте соответствующие разведения в PBT. Биотин-сопряженных вторичными антителами: различные поставщики продают биотин-конъюгированных антител.