Методическая статья
Лазерная микродиссекции была применена для анализа профилей экспрессии генов в определенных отсеках крыла Drosophila диск подвергается локализованных RNAi В естественных условиях. РНК, выделенная из приравненных к ним местностях из замолчать и unsilenced отсеки были проанализированы количественные-ПЦР для определения сравнительных профилирования экспрессии генов в контексте родной микроэкологии ткани.
Гетерогенная природа тканей оказалась ограничивающим фактором в объеме информации, которую можно получить из биологических образцов, что затрудняет последующий анализ. Учитывая сложные и динамичные клеточные ассоциации, существующие во многих тканях, для воспроизведения взаимодействий in vivo при тщательном молекулярном анализе необходимо иметь возможность исследовать специфические популяции клеток в их естественном контексте. Лазерная микродиссекция позволяет достичь этой цели, обеспечивая однозначную идентификацию и успешный сбор интересующих клеток под прямым микроскопическим контролем при сохранении молекулярной целостности. Мы применили эту технологию для анализа экспрессии генов в определенных областях развивающегося имагинального диска крыла Drosophila, который представляет собой удобную модельную систему для изучения контроля роста, дифференцировки клеток и органогенеза. Имагинальные диски личинок заранее разделены на передний и задний, дорсальный и вентральный компартменты границами ограничения линий развития. Используя индуцибельную бинарную систему экспрессии GAL4-UAS, каждый из этих компартментов можно специфически пометить в трансгенных мухах, экспрессирующих трансген UAS-GFP под контролем соответствующей конструкции GAL4-драйвера. В таких трансгенных дисках профили экспрессии генов дискретных подмножеств клеток могут быть точно определены после лазерной микродиссекции, при которой флуоресцентный сигнал GFP служит ориентиром для лазерного разреза.
Среди множества вариантов последующего применения мы сосредоточились на профилировании транскриптов РНК после локальной РНК-интерференции (РНКi). С появлением технологии РНКi маркировку GFP можно сочетать с локальным нокдауном определенного гена, что позволяет определить транскрипционный ответ конкретной популяции клеток на специфическое сайленсинг гена. Чтобы подтвердить эффективность этого подхода, мы выделили эквивалентные области диска из заднего (маркированного экспрессией GFP) и переднего (немаркированного) компартмента при региональном сайленсинге в P-компартменте гена, который в остальных случаях экспрессируется повсеместно. РНК была экстрагирована из микродиссекированных зон с сайленсингом и без него, после чего профилирование сравнительной экспрессии генов определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (RT-PCR). Мы демонстрируем, что данный метод может быть эффективно применен для точного транскриптомного анализа подмножеств клеток в имагинальных дисках Drosophila. Действительно, хотя подготовка массивного диска как источника РНК обычно предполагает гомогенность клеток, общеизвестно, что транскрипционная экспрессия может сильно варьировать внутри этих структур вследствие позиционной информации. Использование локализованного флуоресцентного сигнала GFP для наведения лазерного разреза позволяет проводить более точный транскрипционный анализ, который может быть с пользой применен в различных целях, включая профилирование транскриптов отдельных клеточных линий в их естественном контексте.
Часть 1. Подготовка дрозофилы имагинальных крыла диски подвергнутого конкретные и локализованных РНК-интерференции.
Как биологический материал, мы использовали дрозофилы имагинальных крыло диски полученные из трансгенных личинки подвергаются локализованы и конкретных генов с помощью системы GAL4/UAS 1. Это личиночная потомства orginates от генетических крест с участием двух родительских линий: один несет GAL4 водителя, второй UAS ответчик. Кроме того, чтобы выразить GAL4 в шаблоне конкретных временных и / или пространственное, пилотов несет UAS-GFP репортеру, что позволяет визуализировать GAL4 выражение домена. Линия UAS ответчик заявляет, под контролем последовательности UAS, шпильки глушителей РНК (hpRNA), способных непосредственно для выбранного гена (назовем его ген Х) 2. После экспрессии в клетке, hpRNA X расщепляется для создания малых интерферирующих РНК (миРНК), способных специально молчание выбранных генов. В личиночной потомство, которое несет водителя и ответчик трансгенов, UAS-глушителей построить только транскрибируется в тех клеток, экспрессирующих белок GAL4, и таким образом может вызвать пространственно ограниченных молчание выбранный ген X.
Среди множества возможных применений, мы применили этот подход, чтобы заставить замолчать выбран ген наш интерес (ген X) под контролем engrailed-GAL4 (англ.) драйвер, который может вызвать определенный глушителей в заднем отсеке крыла диск 3 , на территории которого был отмечен выражением UAS-GFP трансгена.
Замолчать имагинальных дисков крыла были ручной рассеченные, заботясь, чтобы ликвидировать загрязнение окружающей ткани, особенно придерживаясь трахеи. Каждый диск изолированных крыла была затем быстро и аккуратно переданы ранее получавших лечение, РНКазы свободных кадров для немедленного вскрытия микродиссекции лазерной отдельных областях.
Часть 2. Лазерная микродиссекции отдельных районах от замолчать (задняя) и unsilenced (передний) отсеков крыла диска.
Как только крыло диск был на мембране, лазерная микродиссекции конкретных областях от замолчать (задняя; GFP-меченых) и unsilenced (передний, GFP-немеченого) отсеков была достигнута. Это был выполнен рисунок области, которые могли бы легко поместиться в обоих, GFP-положительных и GFP-отрицательные стороны диска. Под microdissector, мы сначала сосредоточены лазерный луч на GFP-положительных ткани, делая разрез вдоль выбранного периметру. Microdissector продолжает резки на выбранной скорости и мощности, но это можно уточнить резка вручную, до выбранной области ткани попадает в трубку внизу. Эта трубка содержит небольшой объем TRI реагентом, таким образом, что GFP-положительных ткань готова к последующей экстракции РНК.
Впоследствии мы переехали лесосеки на противоположную, GFP-отрицательные стороны крыла диск, для того, чтобы рассекать эквивалентную территорию от unsilenced, GFP-отрицательные ткани. Еще раз, после автоматического отключения, мы приступили к переработке вырезать вручную. После разреза было сделано, и GFP-отрицательные тканей было обнаружено в TRI реагент, готовый для добычи РНК.
Часть 3. Добыча и РНК Транскрипция профилирования из микродиссекции участков ткани.
Мы нити трубы, чтобы отделить жидкость от шапки и добавил TRI реагентом до 1 мл, а затем производится экстракция РНК в соответствии со стандартным протоколом TRI реагентом. Чтобы собрать достаточно материала, мы повторили процедуру резки на 100 имагинальных дисков крыла. Начиная от: 100 районов примерно 5000 мкм 2 каждый наш выход был в 1,5 мкг РНК. Точность ручной рассечение было тогда контролируется проверкой GFP выражение в замолчать и unsilenced образцов RT-PCR, используя супер Сценарий III (Invitrogen) для синтеза кДНК со случайными гексамеров. Последующие количественного анализа сосредоточены, чтобы определить уровни экспрессии гена замолчать X, вместе с теми, предполагаемых целей своих регулирующих пути, были выполнены в режиме реального времени RT-ПЦР с использованием Master Mix (Invitrogen).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Что касается их основной уровень экспрессии, достигнутые в передних / задних отсеков unsilenced диски крыло, активность выбранных X ген был обнаружен снижается до 40% от глушителя. В отличие от этого, одним из ее предполагаемых мишеней (генов Y) было найдено значительное до регулируемой (7 раз-увеличение), что приводит нас к проверке гипотезы, что это негативно регулируется геном X.
Мы заключаем, что описанные выше экспериментальный подход может успешно применяться для проверки предполагаемы...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы выражают благодарность проф. Кьяра Кампанелла и AMRA Центр Компетенции, Университет Федерико II в Неаполе, Неаполь, Италия, для обеспечения их использования microdissector лазер, и г-н Винченцо Vicidomini за щедрую помощь в 3D-анимации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Fly штаммов
Дрозофилы UAS-глушителей линии могут быть получены из VDRC RNAi коллекция 2. Коллекция GAL4-драйвер линии можно найти на Блумингтон дрозофилы сток центр (Индиана, США).
Оборудование
Необходимое оборудование включает в себя лазерный microdissector (Leica LMD6000), Coulter микроцентрифужную 22R (Beckman), ПЦР (BIO-RAD Мой Cycler), ПЦР в реальном времени (BIO-RAD iQ5).
Инструменты
Необходимые инструменты включают в себя: стекло скважин, кисть, микродиссекции щипцы, висящие слайды капли, насекомых контакты установлены на шприц иглы, металлические каркасы с ПЭТ мембраны, пластиковые трубы (50 мл, 05 мл, 0,25 мл).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение