Лазерная микродиссекция Применительно к экспрессии генов Профилирование подмножество ячеек из Drosophila Крыло диска

Summary

Лазерная микродиссекции была применена для анализа профилей экспрессии генов в определенных отсеках крыла Drosophila диск подвергается локализованных RNAi В естественных условиях. РНК, выделенная из приравненных к ним местностях из замолчать и unsilenced отсеки были проанализированы количественные-ПЦР для определения сравнительных профилирования экспрессии генов в контексте родной микроэкологии ткани.

Abstract

Гетерогенная природа тканей оказалась ограничивающим фактором в объеме информации, которая может быть получена из биологических образцов, ставя под угрозу последующие анализы. Учитывая сложные и динамичные клеточные ассоциации, существующие во многих тканях, для того, чтобы провести тщательный молекулярный анализ взаимодействий in vivo, необходимо иметь возможность анализировать конкретные клеточные популяции в их естественном контексте. Лазерно-опосредованная микродиссекция может достичь этой цели, позволяя однозначно идентифицировать и успешно собирать интересующие клетки при прямой микроскопической визуализации при сохранении молекулярной целостности. Мы применили эту технологию для анализа экспрессии генов в определенных областях развивающегося диска крыльев дрозофилы, который представляет собой выгодную модельную систему для изучения контроля роста, дифференцировки клеток и органогенеза. Имагинальные диски личинок предварительно подразделяются на передние и задние, дорсальные и вентральные компартменты границами линейного ограничения. Используя индуцируемую систему бинарной экспрессии GAL4-UAS, каждый из этих компартментов может быть специфически помечен у трансгенных мух, экспрессирующих трансген UAS-GFP под контролем соответствующей конструкции GAL4-драйвера. В трансгенных дисках профилирование экспрессии генов дискретных подмножеств клеток может быть точно определено после микродиссекции, опосредованной лазером, с использованием флуоресцентного сигнала GFP для лазерной резки.

Среди разнообразия последующих применений мы сосредоточились на профилировании РНК-транскриптов после локализованной РНК-интерференции (РНК-интерференции). С появлением технологии РНК-интерференции мечение GFP может сочетаться с локализованным нокдауном данного гена, что позволяет определить транскрипционный ответ дискретной клеточной популяции на сайленсинг конкретного гена. Чтобы проверить этот подход, мы рассекли эквивалентные участки диска из заднего (помеченного экспрессией GFP) и переднего (немеченного) отдела при региональном сайленсинге в Р-компартменте гена, который в противном случае экспрессировался повсеместно. РНК экстрагировали из микродиссектированных, молчащих и неглуших, а сравнительное профилирование экспрессии генов определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Мы показываем, что этот метод может быть эффективно применен для точной транскриптомики подмножеств клеток в имагинальных дисках дрозофилы. Действительно, в то время как массивный препарат диска в качестве источника РНК обычно предполагает однородность клеток, хорошо известно, что экспрессия транскрипции может сильно варьироваться в этих структурах в зависимости от позиционной информации. Используя локализованный флуоресцентный сигнал GFP для направления лазерной резки, можно проводить более точный транскрипционный анализ, который может быть с пользой применен в разрозненных приложениях, включая транскриптографическое профилирование различных клеточных линий в их естественном контексте.

Protocol

Часть 1. Подготовка дрозофилы имагинальных крыла диски подвергнутого конкретные и локализованных РНК-интерференции.

Как биологический материал, мы использовали дрозофилы имагинальных крыло диски полученные из трансгенных личинки подвергаются локализованы и конкретных генов с помощью системы GAL4/UAS ^1. Это личиночная потомства orginates от генетических крест с участием двух родительских линий: один несет GAL4 водителя, второй UAS ответчик. Кроме того, чтобы выразить GAL4 в шаблоне конкретных временных и / или пространственное, пилотов несет UAS-GFP репортеру, что позволяет визуализировать GAL4 выражение домена. Линия UAS ответчик заявляет, под контролем последовательности UAS, шпильки глушителей РНК (hpRNA), способных непосредственно для выбранного гена (назовем его ген Х) ^2. После экспрессии в клетке, hpRNA X расщепляется для создания малых интерферирующих РНК (миРНК), способных специально молчание выбранных генов. В личиночной потомство, которое несет водителя и ответчик трансгенов, UAS-глушителей построить только транскрибируется в тех клеток, экспрессирующих белок GAL4, и таким образом может вызвать пространственно ограниченных молчание выбранный ген X.

Среди множества возможных применений, мы применили этот подход, чтобы заставить замолчать выбран ген наш интерес (ген X) под контролем engrailed-GAL4 (англ.) драйвер, который может вызвать определенный глушителей в заднем отсеке крыла диск ³ , на территории которого был отмечен выражением UAS-GFP трансгена.

Замолчать имагинальных дисков крыла были ручной рассеченные, заботясь, чтобы ликвидировать загрязнение окружающей ткани, особенно придерживаясь трахеи. Каждый диск изолированных крыла была затем быстро и аккуратно переданы ранее получавших лечение, РНКазы свободных кадров для немедленного вскрытия микродиссекции лазерной отдельных областях.

Часть 2. Лазерная микродиссекции отдельных районах от замолчать (задняя) и unsilenced (передний) отсеков крыла диска.

Как только крыло диск был на мембране, лазерная микродиссекции конкретных областях от замолчать (задняя; GFP-меченых) и unsilenced (передний, GFP-немеченого) отсеков была достигнута. Это был выполнен рисунок области, которые могли бы легко поместиться в обоих, GFP-положительных и GFP-отрицательные стороны диска. Под microdissector, мы сначала сосредоточены лазерный луч на GFP-положительных ткани, делая разрез вдоль выбранного периметру. Microdissector продолжает резки на выбранной скорости и мощности, но это можно уточнить резка вручную, до выбранной области ткани попадает в трубку внизу. Эта трубка содержит небольшой объем TRI реагентом, таким образом, что GFP-положительных ткань готова к последующей экстракции РНК.

Впоследствии мы переехали лесосеки на противоположную, GFP-отрицательные стороны крыла диск, для того, чтобы рассекать эквивалентную территорию от unsilenced, GFP-отрицательные ткани. Еще раз, после автоматического отключения, мы приступили к переработке вырезать вручную. После разреза было сделано, и GFP-отрицательные тканей было обнаружено в TRI реагент, готовый для добычи РНК.

Часть 3. Добыча и РНК Транскрипция профилирования из микродиссекции участков ткани.

Мы нити трубы, чтобы отделить жидкость от шапки и добавил TRI реагентом до 1 мл, а затем производится экстракция РНК в соответствии со стандартным протоколом TRI реагентом. Чтобы собрать достаточно материала, мы повторили процедуру резки на 100 имагинальных дисков крыла. Начиная от: 100 районов примерно 5000 мкм ² каждый наш выход был в 1,5 мкг РНК. Точность ручной рассечение было тогда контролируется проверкой GFP выражение в замолчать и unsilenced образцов RT-PCR, используя супер Сценарий III (Invitrogen) для синтеза кДНК со случайными гексамеров. Последующие количественного анализа сосредоточены, чтобы определить уровни экспрессии гена замолчать X, вместе с теми, предполагаемых целей своих регулирующих пути, были выполнены в режиме реального времени RT-ПЦР с использованием Master Mix (Invitrogen).

Discussion

Что касается их основной уровень экспрессии, достигнутые в передних / задних отсеков unsilenced диски крыло, активность выбранных X ген был обнаружен снижается до 40% от глушителя. В отличие от этого, одним из ее предполагаемых мишеней (генов Y) было найдено значительное до регулируемой (7 раз-увеличение), что приводит нас к проверке гипотезы, что это негативно регулируется геном X.

Мы заключаем, что описанные выше экспериментальный подход может успешно применяться для проверки предполагаемы...

Materials