Экспериментальные Пробирной метастазы

Краткое содержание

В этой статье описываются процедуры анализа экспериментальных метастазов, который используется для определения метастатического потенциала человеческих клеточных линий рака.

Аннотация

Метастазы являются основной причиной смерти у онкологических больных. Чтобы понять механизм метастазирования, экспериментальные анализа метастазы был установлен с использованием иммунодефицитных мышей. Данная статья описывает процедуры, связанные в этом анализе, в том числе подготовка проб, внутривенные инъекции, и культивирования клеток от метастазов в легких. Короче говоря, заранее оговоренное число раковых клеток человека были подготовлены

Протокол

1. Подготовка образцов

1. Расти клетки ~ 70% сливающийся в их конкретных средств массовой информации с факторами роста или FBS (например, DMEM с 10% FBS для МС-1 клеток). Аспирируйте средств массовой информации из пластины и аккуратно мыть несколько раз с 1 х PBS (8 г / л NaCl, 0,2 г / л KCl, 1,15 г / л Na ₂ HPO ₄ .7 H ₂ O, 0,2 г / л KH ₂ PO _4, рН 7,3).
2. Аспирируйте PBS и добавьте 2 мл 0,05% трипсина в версена (0,014 г / л фенола красного и 0,2 г / л ЭДТА-Na в 1 х PBS, рН 7,2). Аккуратно каменную плиту, чтобы облегчить ячейки отрыв от пластины. Соблюдайте клетки под микроскопом. Обычно это занимает 2-5 минут для клеток необходимо отсоединить.
3. Добавить достаточным объемом сред, содержащих FBS (или ингибитором трипсина сои), чтобы утолить трипсин активности и сбора клеток в 50 мл трубки сокола. Граф клеток с использованием hemacytometer. Нагрузка 10 мкл суспензии клеток на чистую hemacytometer. Число клеток в мл равна средней # клеток в каждом из пяти квадратов умножается на 10 ^4.
4. Центрифуга клетки при 1000 оборотов в минуту (или ~ 200 мкг) в настольных центрифуг в течение 3 минут.
5. Осторожно снимите СМИ, не нарушая клеточный осадок. Ресуспендируют клеток в соответствующий объем Хэнкс Сбалансированный буферного раствора (HBSS), чтобы достичь конечной концентрации ~ 5 х 10 ^{6 клеток} / мл.
6. Фильтры клеток через Сокол 70 мкм сито ячейки, чтобы исключить крупные агрегаты клеток. Место кончика пипетки непосредственно на фильтре более помечены 5 мл трубку культуры Falcon. Быстро извлечь суспензии через фильтр в пробирку.
7. Граф еще раз, используя клетки hemacytometer и разбавить их конечной концентрации 2,5 х 10 ⁶ / мл. Держите клетки на льду.
8. Определение жизнеспособности клеток. Смешайте несколько клеток с трипанового синего и измерить процентное содержание мертвых (синий) клетки более общий клеток с использованием hemacytometer. Жизнеспособность клеток должна быть ≥ 90% перед инъекцией.

2. Внутривенных инъекций

1. Изменение перчатки. Аккуратно захватите хвост иммунодефицитных мышей (ню, NOD-SCID, или ГЯП, Лаборатория Джексона) и потяните ее на мыши фиксатор, с его спиной к щели и хвост, торчащие из маленького отверстия в задней части фиксатор .
2. Медленно слайд кольцо внутрь вдоль щели и зафиксировать ее на месте когда-то кольцо бросается в устье мыши. Мышь не должны иметь возможность свободно передвигаться, но должны иметь нормальный темп дыхания.
3. Найти основные вены хвоста. Четыре крупных кровеносных сосудов присутствуют в мышь хвоста. Кровеносные сосуды на спинной и брюшной сторонах хвоста артерий. Вены находятся на боковых сторонах хвоста.
4. Нарисуйте более 200 мкл подготовленных клеток в 1 мл шприца. Прикрепить 30 G1 / 2 дюйма иглы и вытолкнуть пузырьков воздуха, которые могут существовать. Конечный объем клеток в шприце должно быть 200 мкл (например, 5 х 10 ^{5 клеток} в общей сложности).
5. Inject клетки в хвостовую вену.
   1. Начните с дистального конца хвоста, так что если первый процесс не удается, более проксимальной области хвоста могут быть использованы для второй попытки.
   2. Протрите хвост с 70% этанола. Потяните хвост прямой. Держите кончик хвоста с большим и поддержку точки для инъекций с указательным пальцем.
   3. Вставьте иглу в вену и ввести клетки. Убедитесь в том, игл и шприцев параллельны вены во время инъекции, иначе игла будет тыкать через стенку сосуда и придать клеток в окружающие ткани хвоста.
   4. Снять иглу после инъекции. Кровь следует обильно из места инъекции, если инъекции прошел успешно. Пресс чистый кусок бумажной салфеткой или ватным тампоном на месте инъекции для облегчения свертывания крови, и ощупывать хвостом вверх, чтобы подтолкнуть любой остаточной образца в вену в обращение.
   5. Отпустите кнопку мыши, из фиксатор и вернуть его в клетку. Запись инъекции процесса (например, сколько попыток понадобилось вводить клетки и сколько клетки вводили) в лаборатории ноутбука.
   6. Определить жизнеспособность клеток после инъекции, как описано в разделе подготовки проб, Шаг 9. Этот шаг дает уверенность в том, что клетки, остаться в живых протяжении процесса впрыска. В конце эксперимента инъекции, жизнеспособность клеток будет снижаться, но должна быть выше 80%.
   7. (Опционально) спином вниз оставшиеся клетки и промыть гранулы с PBS один раз. Замораживание гранул при температуре -80 ° С для будущего анализа (например, западная пятна, чтобы подтвердить экспрессии генов или нокдаунов).
6. Обычно после одного-двух месяцев, мышей будет расчленена и расположения метастазов грубо определена. Легких является основной сайт для метастазирования, так как он содержит первую капиллярного русла, что клетки встреча после того как онивведите обращении.
7. После промывки PBS, каждый доли легкого (или других тканей, содержащих метастазов) наблюдается при вскрытии микроскопа (рис. 1). Число обнаруживаемых метастазов по обе стороны легких считается и количество метастазов в легких на все четыре доли складываются как общее количество метастазов в легких. ¹ метастазов легкого легче обнаружить, если легкие фиксировали в формалине ночь , так как метастазы будет apppear как белесые пятна, в отличие от соседней темной легкого коричневого тканей.

3. Культивирования клеток от метастазов в легких

1. Метастазов в легких изолированы от вводили мышам. Каждый из них должен быть культурным отдельно.
2. Каждый метастазы измельчается до конца колпачок с иглы (стерильные) на 70 ячейки фильтра мкм.
3. Промойте ячейки фильтра с несколькими мл средних и собранных клеток, которые проходят через фильтр в культуре блюдо.
4. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение по крайней мере, четыре дня без нарушений.
5. Смыть крови или тканей мусора на блюдо с PBS.
6. Добавить свежую среду. В начале, как раковые клетки и фибробласты клетки растут на пластинках, но постепенно, клеток фибробластов вымрет и будет заменен раковых клеток. Если раковые клетки несут никакой гены лекарственной устойчивостью, выделите ячейки с соответствующими антибиотиками.
7. Чистотой клеток, полученных является методом иммуногистохимии с использованием антител против человека-специфических белков. Мы используем анти-человеческий виментин антител (NCL-ВИМ-V9, Novocastra). Клетки мы получили обычно содержат более 99% клеток человека, даже в случае отсутствия наркотика выбора. Вновь клеток, полученных могло быть введен снова в иммунодефицитных мышей, чтобы проверить их метастатической способности, как описано выше.

4. Представитель Результаты

1. В конце этого теста, высокой метастатической линии раковых клеток обычно возникает много метастаз легких (рис. 1), ¹ в то время как очень немногие метастазы легких будет поступать из плохо метастатическим линии клеток рака.
2. Клетки, полученные с помощью этого метода обычно приводит к более метастазов, чем родительские линии, когда они проверяются еще раз, используя результаты анализа. ^1-3

Рисунок 1. Представителю изображения мышью легких после хвостовую вену инъекции раковых клеток. 5 х 10 ⁵ метастатических линии человеческих клеток меланомы, С. М. клетки, ⁴ вводили в хвостовую вену иммунодефицитных мышей. Два месяца спустя, легкие были изолированы и метастазы были обнаружены рассеянные среди нормальной ткани легкого.

Обсуждение

Метастазы являются основной причиной смерти у онкологических больных. Она включает в себя четыре основных этапа: отряд раковые клетки от их основных локусов, их вступление в обращении (intravasation), их выезда из кровообращения (кровоизлияние), а выживание и рост в далеком органа. Метастазы в человеческой считается медленным процессом и часто проявляется после нескольких лет ожидания. Для изучения его прогрессирования своевременно, выше относительно быстро экспериментального анализа была создана в иммунодефицитных мыше...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM	Invitrogen	10313-021
FBS	Hyclone	SH30088.03
HBSS	Invitrogen	14175-095
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
KCl	Mallinckrodt Baker Inc.	6838-04
Na2 HPO4.7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	7896-04
KH2PO4	Mallinckrodt Baker Inc.	7100-12
Фенол красный	Sigma-Aldrich	P3532
EDTA-Na	EMD Millipore	4010
Трипановый	синий Invitrogen	15250-061
Трипсин 2,5%	Invitrogen	15090-046
Этанол	ультрачистый	200-CSGP
50 мл Falcon Tube	VWR международный	89039-656
Микроцентрифужные пробирки	Axygen Scientific	MCT-175-C
Falcon 70μ m Клеточный фильтр	BD Biosciences	352350
5мл Falcon Culture Tube	VWR international	60818-576
Гемацитометр	Hausser Scientific	15170-208
1 мл шприц	BD Biosciences	329650
30 ½ измерительная игла	BD Biosciences	305106
Мышиный ограничитель	Plas Labs Inc.	551-BSRR
Хирургические ножницы	Fisher Scientific	08-940
Щипцы	Fisher Scientific	08-902
Препарирующий микроскоп	Nikon Instruments	SMZ1500
настольной центрифугой	Thermo Fisher Scientific, Inc.