Методическая статья

Иммуноцитохимическая Анализ стволовых клеток человека плюрипотентных использованием Self-Made цитоспина аппарата

DOI:

10.3791/1944

⸱

9 апреля 2010 г.

 ,  , 
1Department of Chemical and Life Sciences Engineering, Virginia Commonwealth University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подвеска иммуноцитохимического окрашивания клеток человека плюрипотентных стволовых (hPSCs) на поверхности клеток маркеры (SSEA-3/SSEA-4) был достигнут на основе использования самодельных цитоспина аппарат для создания монослоя клеток для наблюдения и количественной оценки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), которые включают человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) являются захватывающими источников ячейки из-за их безграничную самообновлению возможности и свой потенциал к дифференцировке в различные типы клеток. Плюрипотентных состояние hPSCs, как правило, оцениваются методы, такие как КПЦР, иммуноцитохимия, а также другими

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Часть 1: Подвеска Иммуноцитохимическая Окрашивание

  1. Клетки собирают в единое клеточной суспензии.
  2. Затем клетки переносят в 1,5-2 мл труб микроцентрифужных и центрифугировали при 200g в течение 4 минут.
  3. Клетки омываются аспирационных из супернатанта, ресуспендировали в 1 мл PBS - (без Mg 2 + и Са 2 +), а затем снова центрифугировали при 200g в течение 4 минут. Это должно быть сделано в два раза.
  4. После мытья клетки затем фиксированной путем повторного приостановления их действия в 1 мл 4% параформальдегида (PFA) при комнатной температуре в течение 10 минут.
  5. Клетки снова промывают два раза с 1 мл PBS -.
  6. После промывки блока клетки путем повторного приостановления их действия в 1 мл блока Решение (6% serum/94% PBS -). Инкубируйте эти при комнатной температуре в течение 45 минут.
  7. После, центрифужные пробирки на 200 г в течение 4 минут и аспирата из Блока решение. Повторное приостановить клеток в 1 мл первичного решение антител (сделанный с Блок решения, при рекомендуемой разведение). Клетки могут быть инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при температуре 4 ° С в течение ночи, прежде чем переходить к следующему шагу.
  8. Затем клетки дважды промывали 1 мл блока решение.
  9. После, вновь приостановить клеток в 1 мл вторичного антитела решение (сделанный с Блок решения, при рекомендуемой разведение) и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
  10. Через 1 час, камеры должны быть затем снова промывают два раза с 1 мл блока решение.
  11. После промывки блока решений, мыть клетки снова с 1 мл PBS -.
  12. После различных моет, вновь приостановить клеток в 1 мл DAPI ядерной пятна (1:10000 разбавления DAPI в ФБР -) и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
  13. Через 5 минут пробирок на 200 г в течение 4 минут. Аспирацию из DAPI ядерной пятно решение и вновь приостановить клеток в 1 мл PBS -.

Часть 2: Включение hPSCs в слайдах порожденных через аппарат цитоспина

  1. Пластиковые слайды готовы, сделав необходимое количество отверстий в них с сверлильный станок. Диаметра должна быть не более 1 мм больше, чем широкий диаметр кончика микропипетки (ы), которые будут использоваться.
  2. Фильтровальная бумага разрезается на параметры пластиковых слайдов с помощью ножниц.
  3. Отверстия затем сделал в фильтровальную бумагу. Размер отверстия (ы) должны быть достаточно большими, что микропипетки наконечник (ы) подходит ожидающий через него.
  4. После одного из подготовленных слайдов пластиковых находится на вершине, и стекло в помещенных в нижней части разреза фильтровальной бумаги (рис. 1). Слои обеспеченные с лентой.
  5. Максимум 100 мкл (в зависимости от желаемого монослоя плотности) окрашенных суспензии клеток из части 1 затем помещается в верхнюю часть кончика микропипетки (ы).
  6. При необходимости аппарат с сотовыми решение может быть взвешены и противовеса подобной вес создан.
  7. Аппарат цитоспина и противовеса может затем помещаются в настольных центрифуги и центрифугируют при 200g в течение 4 минут.
  8. После центрифугирования аппарата цитоспина тщательно разобраны таким образом, что оленья кожа выбить клетки стекло.
  9. При необходимости, избыток окружающего PBS - на боковые стекла в атмосферный из.
  10. Клетки могут быть просмотрены с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы проверить, желаемый клеточный монослой был достигнут.

Часть 3: Монтаж слайдов

  1. Капли желаемого монтажа СМИ находится непосредственно в центре каждой из областей, содержащих клетки.
  2. После, покровное стекло плавно опускается на слайдах пытается избежать пузырьков воздуха, если возможно.
  3. Превышение монтажа медиа затем удаляется из слайдов.
  4. После этого, стороны крышки скользит запечатаны с лаком для ногтей.
  5. Слайды можно хранить в темном месте хранения, пока результаты наблюдаются и задокументированы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для целей нашей лаборатории, 35-мм блюдо из стволовых клеток культур, выращенных на эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) выделено на иммуноцитохимического процедуру окрашивания для использования с аппаратом цитоспина. Затем клетки, собранные при помощи ферментативного пассажей, удаляя как можно больше слоев MEF это возможно, в одно-клеточной суспензии. Если более эффективной изоляции стволовых клеток из слоя MEF желательно, колонии можно вручную выбрал затем переваривается в подвеске. Если устройство подачи условиях с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Частичное финансирование для этой работы была предоставлена ​​NSF-КАРЬЕРА 0744556 (Rao) и стипендий через VCU-HHMI образования, науки и исследовательской программы (Паскаль).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Lab Tek Permanox Камерное горлоThermo Fisher Scientific, Inc.117437Материал для повторно используемых пластиковых предметных
стекол Superfrost/Plus Предметные стекла для микроскопа Предварительно очищенныеFisher Scientific12-550-15
0,1-10μ L Фильтрующие наконечникиСША Scientific, Inc.1121-3810
Крышка микроскопа FisherScientific120542-B
Cytoseal 280Richard-Allan Scientific8311-4Монтажная среда
DPBSGIBCO, by Life Technologies14190
Нормальная козья сывороткаInvitrogen10000C
Мышь Anti-SSEA-4 Моноклональное антителоEMD MilliporeMAB4304Первичное антитело для окрашивания SSEA-4
Крыса Моноклональное антитело против SSEA-3EMD MilliporeMAB4303Первичное антитело для окрашивания SSEA-3
Alexa Fluor 488 Козье антитело против мыши IgGInvitrogenA11029Вторичное антитело для окрашивания SSEA-4
Alexa Fluor 488 Меченое козье антитело против крысы IgG InvitrogenA11006Вторичное антитело для окрашивания
SSEA-3DAPI, ДигидрохлоридCalbiochem268298

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
  2. Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Human Pluripotent Stem CellsImmunocytochemical AnalysisSelf Made Cytospin ApparatusCell Surface MarkersFlow CytometryStem Cell DifferentiationSSEA3 SSEA4 MarkersMonolayer Cell PreparationCytospin CentrifugationImmunostaining Protocol

Похожие статьи