Подвеска иммуноцитохимического окрашивания клеток человека плюрипотентных стволовых (hPSCs) на поверхности клеток маркеры (SSEA-3/SSEA-4) был достигнут на основе использования самодельных цитоспина аппарат для создания монослоя клеток для наблюдения и количественной оценки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иммуноцитохимическая Анализ стволовых клеток человека плюрипотентных использованием Self-Made цитоспина аппарата
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), которые включают человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) являются захватывающими источников ячейки из-за их безграничную самообновлению возможности и свой потенциал к дифференцировке в различные типы клеток. Плюрипотентных состояние hPSCs, как правило, оцениваются методы, такие как КПЦР, иммуноцитохимия, а также другими
Протокол
Часть 1: Подвеска Иммуноцитохимическая Окрашивание
- Клетки собирают в единое клеточной суспензии.
- Затем клетки переносят в 1,5-2 мл труб микроцентрифужных и центрифугировали при 200g в течение 4 минут.
- Клетки омываются аспирационных из супернатанта, ресуспендировали в 1 мл PBS - (без Mg 2 + и Са 2 +), а затем снова центрифугировали при 200g в течение 4 минут. Это должно быть сделано в два раза.
- После мытья клетки затем фиксированной путем повторного приостановления их действия в 1 мл 4% параформальдегида (PFA) при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Клетки снова промывают два раза с 1 мл PBS -.
- После промывки блока клетки путем повторного приостановления их действия в 1 мл блока Решение (6% serum/94% PBS -). Инкубируйте эти при комнатной температуре в течение 45 минут.
- После, центрифужные пробирки на 200 г в течение 4 минут и аспирата из Блока решение. Повторное приостановить клеток в 1 мл первичного решение антител (сделанный с Блок решения, при рекомендуемой разведение). Клетки могут быть инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при температуре 4 ° С в течение ночи, прежде чем переходить к следующему шагу.
- Затем клетки дважды промывали 1 мл блока решение.
- После, вновь приостановить клеток в 1 мл вторичного антитела решение (сделанный с Блок решения, при рекомендуемой разведение) и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Через 1 час, камеры должны быть затем снова промывают два раза с 1 мл блока решение.
- После промывки блока решений, мыть клетки снова с 1 мл PBS -.
- После различных моет, вновь приостановить клеток в 1 мл DAPI ядерной пятна (1:10000 разбавления DAPI в ФБР -) и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Через 5 минут пробирок на 200 г в течение 4 минут. Аспирацию из DAPI ядерной пятно решение и вновь приостановить клеток в 1 мл PBS -.
Часть 2: Включение hPSCs в слайдах порожденных через аппарат цитоспина
- Пластиковые слайды готовы, сделав необходимое количество отверстий в них с сверлильный станок. Диаметра должна быть не более 1 мм больше, чем широкий диаметр кончика микропипетки (ы), которые будут использоваться.
- Фильтровальная бумага разрезается на параметры пластиковых слайдов с помощью ножниц.
- Отверстия затем сделал в фильтровальную бумагу. Размер отверстия (ы) должны быть достаточно большими, что микропипетки наконечник (ы) подходит ожидающий через него.
- После одного из подготовленных слайдов пластиковых находится на вершине, и стекло в помещенных в нижней части разреза фильтровальной бумаги (рис. 1). Слои обеспеченные с лентой.
- Максимум 100 мкл (в зависимости от желаемого монослоя плотности) окрашенных суспензии клеток из части 1 затем помещается в верхнюю часть кончика микропипетки (ы).
- При необходимости аппарат с сотовыми решение может быть взвешены и противовеса подобной вес создан.
- Аппарат цитоспина и противовеса может затем помещаются в настольных центрифуги и центрифугируют при 200g в течение 4 минут.
- После центрифугирования аппарата цитоспина тщательно разобраны таким образом, что оленья кожа выбить клетки стекло.
- При необходимости, избыток окружающего PBS - на боковые стекла в атмосферный из.
- Клетки могут быть просмотрены с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы проверить, желаемый клеточный монослой был достигнут.
Часть 3: Монтаж слайдов
- Капли желаемого монтажа СМИ находится непосредственно в центре каждой из областей, содержащих клетки.
- После, покровное стекло плавно опускается на слайдах пытается избежать пузырьков воздуха, если возможно.
- Превышение монтажа медиа затем удаляется из слайдов.
- После этого, стороны крышки скользит запечатаны с лаком для ногтей.
- Слайды можно хранить в темном месте хранения, пока результаты наблюдаются и задокументированы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для целей нашей лаборатории, 35-мм блюдо из стволовых клеток культур, выращенных на эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) выделено на иммуноцитохимического процедуру окрашивания для использования с аппаратом цитоспина. Затем клетки, собранные при помощи ферментативного пассажей, удаляя как можно больше слоев MEF это возможно, в одно-клеточной суспензии. Если более эффективной изоляции стволовых клеток из слоя MEF желательно, колонии можно вручную выбрал затем переваривается в подвеске. Если устройство подачи условиях с...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Частичное финансирование для этой работы была предоставлена NSF-КАРЬЕРА 0744556 (Rao) и стипендий через VCU-HHMI образования, науки и исследовательской программы (Паскаль).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Камерные предметные стекла Lab Tek Permanox | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 117437 | Материал для многоразовых пластиковых стекол |
| Предварительно очищенные предметные стекла Superfrost/Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Фильтрующие наконечники 0.1-10μL | USA Scientific, Inc. | 1121-3810 | |
| Покровные стекла для микроскопа | Fisher Scientific | 120542-B | |
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Среда для заключения препаратов |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Нормальная сыворотка козы | Invitrogen | 10000C | |
| Моноклональные антитела мыши ضد SSEA-4 | EMD Millipore | MAB4304 | Первичные антитела для окрашивания SSEA-4 |
| Моноклональные антитела крысы ضد SSEA-3 | EMD Millipore | MAB4303 | Первичные антитела для окрашивания SSEA-3 |
| Alexa Fluor 488 козьи антитела ضد IgG мыши | Invitrogen | A11029 | Вторичные антитела для окрашивания SSEA-4 |
| Меченые Alexa Fluor 488 козьи антитела ضد IgG крысы | Invitrogen | A11006 | Вторичные антитела для окрашивания SSEA-3 |
| DAPI, дигидрохлорид | Calbiochem | 268298 |
Ссылки
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
