Методическая статья

Хронический Сальмонеллы Зараженные Модель мыши

DOI:

10.3791/1947

⸱

31 мая 2010 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Rochester

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Создание хронического бактериального инфицированных мышах со стойкими Сальмонеллы Typhimurium колонизации в кишечнике в течение 27 недель.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериальных инфицированных мышах представляет собой мощную систему моделью для изучения таких областях, как инфекции, воспаления, иммунологии, передача сигнала, и опухолей. Многие исследователи воспользовались колит индуцированных

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол включает в себя три части: бактериальные культуры, мышь желудочный зонд, и сальмонеллы обнаружения.

1. Сальмонеллы условием роста.

  1. Подготовка Salmonella Лурия-Бертани бульон (LB) пластины, инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи.
  2. Выберите клона из LB пластины и введены в 7 мл LB в 12 мл трубки, и трясти при 37 ° С в течение примерно 5 часов.
  3. Привить 50 мл LB с 0,05 мл стационарная фаза культуры и инкубировать при температуре 37 ° C без встряхивания в течение 18 часов.
  4. Спиновые ночь бактериальной культуры при комнатной температуре с 6000 оборотов в минуту в течение 10 минут, приостановить бактерий в HBSS использованием соотношение 100:3 (LB: HBSS). Например:
    Каждые 50 мл LB культуры будет приостановлен в 1,5 HBSS мл.
  5. Для животных желудочный зонд, далее разбавленный бактериальные культуры в 1:10. Например:
    Каждый 1,5 мл LB культуры будет приостановлен в 15 мл HBSS.

2. Salmonella-инфекции модели *.

  1. Подготовка стрептомицин решение. Каждая мышь будет предоставлена ​​7,5 мг стрептомицина в 100 мкл HBSS. Например, подготовить всего 90 мг стрептомицина в 1,2 мл HBSS в течение 10 мышей. Всегда есть дополнительный объем при подготовке стрептомицин решение.
  2. Вывод воды и пищи за 4 часа до устного зонд лечения.
  3. Принудительным кормлением мышей с стрептомицина с 7,5 мг стрептомицина (100 мкл HBSS для контрольных мышей). Захватите кожу над мышью плечо крепко большим и средним пальцами, растянуть головы и шеи с указательным пальцем, чтобы сделать пищевода прямо. Прямой шар-кончик иглы кормление по небу и к правой стороне задней стенке глотки, затем аккуратно пройти вниз в пищевод и вводят 100 мкл раствора. Нет сопротивления должно ощущаться.
  4. В 20 часов после лечения стрептомицином, изъятые воды и пищи еще раз до мышей, инфицированных бактериями.
  5. Желудочный зонд каждой мыши с 100 мкл суспензии в HBSS или обработаны стерильной HBSS (контроля) по устной желудочный зонд. Желудочный зонд процедура такая же, как 2,3) принудительным кормлением мышей с стрептомицин.

Эксперименты * животных проводили с помощью специфических патогенов без женщин C57BL / 6 мышей (Taconic, Гудзон, Нью-Йорк), которые были 6-7 недель, как описано выше 1. Протокол был одобрен Университета Рочестерского университета комитета по ресурсам животных (UCAR).

3. Обнаружение сальмонелл в кишечнике.

  1. Сбор мыши фекальные (около 100 мг).
  2. Передача фекальные образца 1,5 микро центрифужную пробирку с 1 мл PBS и вихревые энергично.
  3. Центрифуга в течение 10 мин при 800 оборотах в минуту. Передача супернатант в чистую пробирку и отцентрифугировать.
  4. Центрифугирования при 6000 оборотов в минуту для 5мин. Супернатант отбрасывается и 200 мкл PBS добавляется в гранулы и встряхивали.
  5. Подряд 200 мкл PBS с одноразовыми разбрасыватель ячейку BBL пластины CHROMagar для обнаружения сальмонеллы. Сальмонеллы видов появляются розовато-лиловый (розового до фиолетового, см. Рис.1). Если 200 мкл дает слишком много колоний на пластину, используйте 100 мкл или 50 мкл для полосу.

4. Представитель результаты.

Когда протокол будет сделано правильно, колонизация Salmonella Typhimurium могут быть обнаружены в кишечнике мышей в течение 6 месяцев. Сальмонеллы могут быть обнаружены фекальные культуры в течение 6 месяцев (рис. 1). В качестве типичного из выйдет из этой модели, тело потери веса и смерти происходит в течение 4 недель после инфекции. В зависимости от сальмонеллы штаммы, используемые для инфекции, некоторые мышей могут не выжить в течение 6 месяцев.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Кишечные сальмонеллы в Salmonella видов появляются розовато-лиловый (розового до пурпурного) цвета, вследствие метаболических различий в присутствии выбранного хромогенов. Другие бактерии, либо подавляется или производить сине-зеленые или бесцветные колонии.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Выживание пропорции мышей, инфицированных сальмонеллой мутантного штамма PhoP с, PhoP с Авра-и PhoP с AvrA-/AvrA +, PhoP с Avra в течение 4 недель (28 дней).

Таблица 1. Масса тела мышей, инфицированных сальмонеллой в течение 4 недель.

0 1 неделя 2-х недель 3 недели 4 недели
контроль 16,78 ± 1,05 16,91 ± 1,28 18,26 ± 1,23 19,31 ± 1,26 20,26 ± 1,15
PhoP с 17,14 ± 1,19 17,43 ± 1,63 * 18,68 ± 1,78 20,05 ± 1,11
PhoP с Авра- 16,91 ± 1,12 16,96 ± 1,39 17,06 ± 2,14 ** 18,71 ± 2,18 20,15 ± 1,56
PhoP с AvrA-/AvrA + 16,94 ± 0,96 17,17 ± 1,02 17,63 ± 1,42 * 18,44 ± 2,03 20,09 ± 1,17
16,89 ± 1,03

* По сравнению с контрольной группой р <0,05
** По сравнению с контрольной группой р <0,01

Таблица 2. Сальмонеллы штаммы, используемые в данном исследовании.

Имя Описание Ссылка или источник
Сальмонелла 14028s Дикого типа С. Typhimurium АТСС
PhoP с Номера для патогенных комплекса регулятор мутант Миллер и соавт., 1990
PhoP с Авра- Авра-мутации Кольер-Hyams и соавт., 2002
PhoP с AvrA-/AvrA + PhoP с Авра-плазмиды с дополняемыми Avra кодирования Кольер-Hyams и соавт., 2002

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для использования этой системы, это необходимо для исследователя чтобы узнать, как зонд животных. Мы подробно методология подготовки бактериальные культуры и принудительным кормлением мышей. Мы также показываем, как осуществлять мониторинг сальмонеллы настойчивость в желудочно-кишечном тракта (ЖКТ). Критические шаги в этом протоколе в том числе:

  1. Стрептомицин-предварительной обработки: Стрептомицин-предварительной обработки могли бы избавиться от некоторых синантропных флоры кишечника и сделать мыше...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIDDK KO1 DK075386 гранта и Американского онкологического общества RSG-09-075-01-MBC в июне ВС

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HBSSSigma-AldrichABCD1234
Бульон Луриа-БертаниBD Biosciences244610
Игла для кормленияPopper & Sons, Inc.7920
СтрептомицинMP Biomedicals100556
BBL CHROMagar SalmonellaBD Biosciences214983
Одноразовые шпатели для посева клетокBiologix Research Company65-1010

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
  2. Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
  3. Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
  4. Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
  5. Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
  6. Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
  7. Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
  8. Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
  9. Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
  10. Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
  11. Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
  12. Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
  13. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).
  14. Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , Forthcoming (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SalmonellaSalmonella

Похожие статьи