Это видео демонстрирует технику для извлечения ДНК из видов микробов резидентом в задней кишке термитов. Подготовка слайд мокрыми гору, которая полезна для визуализации сообщества кишечнике микробные иллюстрируется также и тур по богатых видами среды кишечника дается.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Извлечение ДНК из Gut микробы Термит (Zootermopsis Angusticollis) и Визуализация Gut Микробы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Термиты являются одними из немногих животных, как известно, способность существовать исключительно за счет потребления древесины. Термита тракта кишки содержит плотные и богатые видами микробной популяции, что способствует деградации лигноцеллюлозы преимущественно в ацетат, основным питательным веществом заправки термитов метаболизм (Odelson и Breznak, 1983). В рамках этих микробных популяций бактерии, археи метаногенных, а в некоторых («нижнее») термитов, эукариотических простейших. Таким образом, термиты отлично предметов исследования для изучения взаимодействия между видов микроорганизмов и многочисленных биохимических функций, которые они выполняют в пользу хозяина. Видовой состав микробных популяций в борьбе с термитами кишки, а также ключевые гены, вовлеченные в различные биохимические процессы были изучены с использованием молекулярных методов (Кудо и др., 1998;. Шмит-Вагнера и др., 2003;. Salmassi & Лидбеттер, 2003). Эти методы зависят от добычи и очистки высококачественных нуклеиновых кислот из термита среде кишечника. Добыча методике, описанной в этом видео представляет собой модифицированный составления протоколов, разработанных для добычи и очистки нуклеиновых кислот из проб окружающей среды (Мор и др., 1994;. Berthelet и др., 1996;. Парди и др., 1996;. Salmassi & Лидбеттер, 2003;. Оттесен и др. 2006), и он производит ДНК от термитов кишке материала, пригодного для использования в качестве шаблона для полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Протокол
Процедурные резюме для борьбы с термитами целом кишки экстракции ДНК:
- Холод термитов на льду, удалить кишечник использованием стерильного пинцета и стабилизировать кишки образцы в буфере.
- Однородный образцов в PVPP / SDS / фенола буфера.
- Извлечение и очистить ДНК из сырой лизат использованием Qiagen DNeasy столбцов.
Протокол:
- На льду, удалить внутренности от работника касты термитов использованием стерильных щипцов.
- Сразу передачи кишки и содержимое стерильным, нуклеазы без трубки, содержащей 50 мкл ледяной 1x молекулярной биологии классе TE буфера (1 мМ Трис-HCl, 0,1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Замораживание образцов при -20 ° С, или перейти непосредственно с гомогенизации.
- Передача кишки образцов и буфер для стерильной, нуклеазы, свободных 2 мл винта ограничен трубки с предустановленной 500 мг стерильной циркония / диоксид кремния бисером (0,1 мм) и 700 мкл буфера TE 1x, содержащей 1% вес / polyvinylpolypyrrolidone (PVPP ).
- Добавить 50 мкл 20% додецилсульфата натрия (SDS) и 500 мкл фенола в пробах.
- Однородный (шарик бить) на максимальных настройках с использованием трех циклов 30 гомогенизации сек и 30 сек охлаждение на льду.
- Осадка нерастворимого материала в течение 1 мин при 8000 х г.
- Purify 300-мкл аликвоты водный (верхний) слой с Qiagen DNeasy столбцов с помощью метода, описанного на сырую очистки лизата.
- Количественно содержание нуклеиновых кислот и заморозить образцы при -20 ° C для дальнейшего использования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
По нашему опыту, ДНК, извлеченной из микробных сообществ древесных видов термитов кормления, как nevadensis Zootermopis является достаточно чистым для шаблона ПЦР после одного раунда добычи и очистки. Однако, некоторые термиты, такие как мусор грудью и почвы вскармливание вид может иметь более высокую концентрацию гуминовых кислот в их содержимого кишечника и может потребоваться дополнительная очистка кишечника ДНК микроорганизмов. Суммарный выход ДНК из кишки 5 рабочих З. nevadensis находится в диапазоне 10-30 мкг. Для борьбы с термитами в...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| PVPP/SDS/фенол | Буфер | буфер для гомогенизации | ||
| DNeasy Tissue Kit | Набор | Qiagen | 77607 | Использовался в соответствии с протоколом выделения геномной ДНК из сырых лизатов (Приложение H, руководство по продукту, версия: июль 2003 г.) |
| TE | Буфер | Sigma-Aldrich | T9285 | 1x буфер (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), приготовленный из 100x концентрата |
| циркониевые/кремнистые бусины | Расходные материалы | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Реагент | Sigma-Aldrich | P6755 | 1% (масс./об.) поливинилполипирролидон, приготовленный из сухого реагента в виде 1x суспензии в TE буфере |
| Zootermopsis nevadensis | Животное | Термиты | ||
| SDS | Реагент | Sigma-Aldrich | L4390 | Додецилсульфат натрия, 20% раствор в воде, приготовленный из сухого реагента |
| Фенол | Реагент | Sigma-Aldrich | 77607 | насыщенный TE буфером, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Инструмент | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Буферный солевой раствор, pH 7.2 | Состав на литр: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl и 10 mL 1 M раствора NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Микроскоп | Carl Zeiss, Inc. | Оснащен объективом 40x, Optivar 1.6x и окулярами 10x. Образцы рассматривали с использованием фазово-контрастного освещения |
Ссылки
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
